QuEChERS净化法快速检测食品中的脱氢乙酸

黄珊，范云燕，孙琦，苏颖

南宁市疾病预防控制中心（南宁 530023）

脱氢乙酸是联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用的一种食品防腐剂，在中国被广泛用于黄油、腌制蔬菜、发酵豆制品、面包、糕点、复合调味料、熟肉制品等食品的防腐，使用范围和添加量都有严格的规定[1]。但是在食品生产加工过程中违规、超标使用脱氢乙酸作防腐剂的现象时有发生，特别是一些小工厂小作坊违规使用食品添加剂的现象尤为严重，带来严重食品安全隐患。因此快速高效经济地检测食品中的脱氢乙酸对食品安全风险监测工作有重要意义。

国家标准中高效液相色谱法是脱氢乙酸检测的常用方法[2-3]。由于样品含有的色素、蛋白质、脂肪及淀粉等基质，对样品的前处理及色谱分析过程有很大影响，因此GB 5009.121—2016中液相色谱法在不同类型的样品提取过程中使用SPE柱进行样品的净化，以达到除杂质的目的，净化的过程工作量大、效率低，且SPE净化柱价格贵。净化后的样品用高效液相色谱进行分析时，由于脱氢乙酸与C18柱中的硅醇基作用，色谱峰易拖尾，不利于定量分析。国内外研究对于样品前处理方法较多的是对蛋白沉淀剂的选择进行相应优化[4-5]，或者前处理过程不净化过滤膜后直接用超高效液相色谱分析[6-8]，也有报道使用蒸馏法提取脱氢乙酸[9]，这些方法要么不能充分除去样品中杂质，要么提取过程复杂耗时长，因此开发一种简单方便的提取净化方法十分必要。对于色谱峰拖尾现象，文献中较多的是使用封端工艺的C18柱解决峰拖尾问题[10-11]，因此摸索一种使用普通C18柱分析检测脱氢乙酸的色谱条件有利于方法的推广与实际应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯，德国Meker公司）；PSA（N-丙基乙二胺）、C18与GCB（石墨化碳黑）粉末（均为安捷伦公司）；脱氢乙酸标准品（纯度99.9%，坛墨质检）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100液相色谱仪（配有DAD检测器）；3K15冷冻离心机（美国Sigma公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×250 mm，5.0 μm）；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长293 nm。

1.3.2 流动相优化

以甲醇+0.02 mol/L的乙酸铵（5∶95）为流动相，用氨水调节流动相的pH 8.0。

1.3.3 标准溶液的配制

准确称取0.100 0 g脱氢乙酸标准物质于100 mL容量瓶中，以水定容至刻度，此溶液为标准储备液，质量浓度1 000 mg/L。吸取10.00 mL脱氢乙酸标准储备液，用水定容至100 mL，质量浓度100 mg/L。分别吸取0.50，1.00，3.00，5.00，8.00，10.00和20.0 mL 100 mg/L标准溶液于25 mL容量瓶，用纯水定容至刻度，配制成2.00，4.00，12.0，20.0，32.0，40.0和80.0 mg/L系列质量浓度。

1.3.4 样品提取

提取。固体样品与半固体样品用均质器均质或粉碎机粉碎、黄油加热融化后备用，液体样品直接称量。称取5.00 g样品于25 mL比色管，加入约15 mL水，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH 8.0后转移至25 mL容量瓶，用水定容至刻度，充分摇匀后超声提取10 min。转移至离心管，以8 000 r/min冷冻离心5 min，上清液备用。

QuEChERS净化[12-14]。取3 mL离心后的上清液，加入0.2 g PSA粉末、0.2 g C18吸附剂和0.1 g GCB（对于含脂肪、蛋白质、淀粉较高的样品可加0.4 g C18吸附剂），涡旋振荡后以10 000 r/min离心2 min，取上清液过0.22 μm水相微孔滤膜后供液相色谱分析。

加标回收试验。分别称取5 g蛋黄酥、蔬菜汁、黄油、辣椒酱、腐乳、火腿肠等样品，加入相应含量的标准溶液，后面操作过程与样品提取净化过程相同。

检出限。称取5 g空白样品，按加标回收试验的操作方法加入相应的标准溶液，提取净化后用高效液相色谱分析，取脱氢乙酸色谱峰附近平稳基线，得到信噪比，计算方法检出限。

2 结果与分析

2.1 流动相条件的选择

通过对中性、酸性、碱性流动相条件下脱氢乙酸在C18柱下分离情况的研究，发现碱性条件下脱氢乙酸色谱峰保留时间显著减小，色谱峰对称性显著好于酸性及中性条件下，通过对色谱条件的进一步优化，结果见表1，最终选择甲醇+0.02 mol/L的乙酸铵（5∶95）为流动相，用氨水调节流动相pH 8.0，在此条件下，色谱峰峰型良好，且该条件下进行的多种样品的加标试验显示，脱氢乙酸峰无干扰峰影响，而其他条件下虽然峰型良好，但是保留时间太小，易产生干扰。图1～图5分别为该条件下脱氢乙酸标准溶液、黄油、蛋黄酥、辣椒酱样品加标及GB 5009.121—2016方法中脱氢乙酸标准品色谱图。

表1 流动相优化结果

图1 浓度4 mg/L脱氢乙酸标准溶液色谱图

图2 浓度3 mg/L黄油加标样品色谱图

图3 浓度6.9 mg/L蛋黄酥加标样品色谱图

图4 浓度4.0 mg/L辣椒酱加标样品色谱图

图5 GB 5009.121—2016中脱氢乙酸标准品色谱图

2.2 线性关系

使用1.3.3中配制的标准溶液对脱氢乙酸做标准曲线，在最佳条件下以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立脱氢乙酸标准曲线，得到标准曲线Y=29.942X-3.109，r=0.999 88，线性关系良好。

2.3 提取方法

使用QuEChERS净化方法对提取样品进行净化，结果显示对于普通样品，取3 mL离心后上清液，加入0.2 g PSA粉末、0.2 g C18吸附剂和0.05 g GCB进行处理，对于脂肪、蛋白质、淀粉含量较高的样品加入0.2 g PSA粉末、0.4 g C18吸附剂和0.05 g GCB进行处理后，色谱峰无显著基质干扰，脱氢乙酸色谱峰无杂峰干扰。图6和图7分别为未经QuEChERS净化和经过QuEChERS净化后的样品提取液加标样色谱图，对比表明经净化后样品杂峰明显减少。

图6 未经QuEChERS净化的蔬菜提取液色谱图

图7 经QuEChERS净化的蔬菜提取液加标样色谱图

2.4 回收率试验

在蛋黄酥、黄油、辣椒酱、蔬菜汁、腐乳及火腿肠等样品中添加不同浓度的脱氢乙酸进行加标回收试验，结果见表2。结果显示，蔬菜、辣椒酱的回收率较好，接近100%，而蛋黄酥、黄油样品加标回收率偏高。这是因为按照GB 5009.121—2016计算结果时，样品提取液总体积V等于定容体积25 mL，实际检测过程中对于液体样品或含水分高的蔬菜汁等样品提取液体积V接近25 mL，但是对于黄油、蛋黄酥等水分含量较低的样品，提取液的真实体积V要远小于25 mL，计算时造成这类样品回收率偏高，在检测黄油等不含水或者含水量极低的样品中脱氢乙酸时，可以将提取方法（取样5 g后加入提取液（pH 8.0）定容至25 mL进行提取）改为取样5 g后准确加入25 mL提取液（pH 8.0）进行提取，这样在计算结果时提取液体积V=25 mL，结果更为准确合理。

2.5 检出限

不同样品的检出限见表3。方法检出限在2.2×10-4～7.5×10-4g/kg之间，符合GB 5009.121—2016中液相色谱法的水平。

表2 脱氢乙酸加标回收率结果与相对标准偏差

表3 脱氢乙酸检出限

3 结论与讨论

在脱氢乙酸的检测中使用QuEChERS法进行净化并在弱碱性流动相条件下使用普通C18柱进行样品的分析。样品在碱性条件下提取离心后，取上清液加入一定量的含PSA、C18和GCB粉末净化，净化液离心后过0.22 μm微孔滤膜后用于高效液相色谱仪分析，在此方法下，脱氢乙酸标准曲线线性、加标回收率、检出限均能达到GB 5009.121—2016水平，且脱氢乙酸色谱峰对称性良好，附近无杂峰干扰。

方法与GB 5009.121—2016中液相色谱法相比具有优点：（1）样品前处理简单方便省时，不需要SPE净化柱，大大节省检测成本；（2）不需要使用封端工艺的C18柱，在普通C18柱下分析脱氢乙酸色谱峰不拖尾，保留时间缩短，加快样品的分析速度。对于食品中脱氢乙酸检测方法的研究，国内外也有许多学者做过相应的研究，但是利用QuEChERS法净化检测食品中脱氢乙酸的方法未见报道。