云南奇楠沉香茶鞣质测定及抗氧化
2020-07-24刘国华阚欢李永霞王代波万合锋
刘国华，阚欢，李永霞，王代波，万合锋
1. 贵州省生物研究所（贵阳 550009）；2. 西南林业大学轻工与食品工程学院（昆明 650224）；3. 贵州省植物园（贵阳 550004）
沉香是瑞香科沉香属（Aquilaria）植物，是中国传统的名贵药材和天然香料，其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效[1]。国产沉香主产于海南、广东等地，进口沉香主产于马来西亚、印度尼西亚、越南等国[2-4]。奇楠沉香（Aquilaria crassna）隶属瑞香科（Thymelaceac）沉香属（Aquilaria），分布于柬埔寨、老挝、泰国、越南等地。2004年，云南省林业技术推广总站与西双版纳青松林业有限公司合作，从越南引种并进行培育[5]；奇楠沉香的香味会有多种变化，悠然淡雅，香味持久；现代科学还没有办法仿制其香味，是养生的上等香料，药用价值高，是一种名贵药用植物，是沉香中的上品。
沉香全身都是宝，尤其是沉香叶（白木香叶）提取物具有抗氧化、降血脂、镇痛、抗癌等生理活性[6]。云南省沉香叶的资源十分丰富，每年可采二季，是沉香产业中值得重点开发的部分。研究表明，沉香叶乙醇回流提取物有显著的抗炎、镇痛、促进小肠运动、泻下、止血、抗脑缺氧、缺血、降糖、抗肿瘤作用。可将沉香叶制成茶叶或保健品，应用于炎症、疼痛、便秘、肥胖、出血、脑缺血、高血糖及肿瘤等相关疾病的辅助治疗[7]。试验以奇楠沉香茶叶为研究对象，测定其鞣质含量，并进行体外抗氧化试验，为奇楠沉香茶的药用奠定一定的基础，促进沉香茶的研究及综合利用，同时也为缓解沉香药材资源紧缺难题提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
沉香茶（西双版纳青松林业有限公司）。待测液准备：取10 g沉香茶叶并破碎成粉末，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，加60 mL水，放置过夜，超声处理（功率500 W、频率40 kHz）10 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置滤过，弃去30 mL初滤液，精密取20 mL续滤液，置100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。
没食子酸、水杨酸、钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、甲醇、磷酸、盐酸、双氧水、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、维生素C、硫酸、DPPH等（均为分析纯）。
HH-2数显电子恒温水浴锅（国华电器有限公司）；DGH-9140A数显电热鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）；Sigma 3K15高速冷冻离心机（Sigma公司）；BT-224S电子天平（Sartorius）；UV-1000紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；超声波处理器（KQ-500DE昆山超声仪器有限公司）；等。
1.2 试验方法
1.2.1 奇楠沉香茶鞣质的测定[8]
1.2.1.1 没食子酸标准曲线的绘制
没食子酸溶液配制参考文献[9-10]采用Folin-Ciocalteui法，FC显色剂及7.5% Na2CO3溶液配制参照文献[11]。分别取0，50，100，150，200，250，300，350和400 μL没食子酸溶液到刻度试管中，用蒸馏水补足到6 mL；依次加入1 mL FC显色剂溶液、3 mL 7.5%Na2CO3溶液，摇匀，得到的没食子酸标准溶液质量浓度分别为0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50和4.00 μg/mL，室温放置显色2 h；在765 nm波长下测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标建立标准曲线。
1.2.1.2 总酚含量的测定
分别吸取50 μL待测样品液到刻度试管中，用蒸馏水补足到6 mL，按顺序加入1 mL FC显色剂溶液、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，室温放置显色2 h，在765 nm波长下测定吸光度。由标准曲线求得对应的总酚质量浓度，以没食子酸计。
1.2.1.3 不被吸附多酚的测定
取25 mL待测样品液，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞锥形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保温1 h并振摇，取出后放冷过滤并弃去初滤液，取10 mL续滤液，置25 mL棕色量瓶中。分别吸取50 μL续滤液到刻度试管中，用蒸馏水补足到6 mL，按顺序加入1 mL FC显色剂溶液、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，室温放置显色2 h，在765 nm波长下测定吸光度。由标准曲线求得对应的不被吸附多酚质量浓度，以没食子酸计。
1.2.1.4 鞣质质量分数的计算[8,12]
鞣质质量（总酚质量与不被吸附多酚质量之差）与沉香叶质量的比值计算鞣质质量分数，如表1所示。
1.2.2 奇楠沉香茶中多酚类物质清除羟自由基的能力
依次取2.0 mL 9 mmol/L的FeSO4，2.0 mL 8.82 mmol/L双氧水，2.0 mL 9 mmol/L的水杨酸溶液于25 mL容量瓶中，向反应体系中分别加入1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL提取液或VC待测液，用蒸馏水定容，摇匀，恒温37 ℃。在510 nm测其吸光度为A1，按此方法不加提取液或VC待测液吸光度为A0，按照此方法不加双氧水测定的吸光度为。
式中：A1为加入待测物后吸光度；At为待测物吸光度；A0为空白对照的吸光度。
1.2.3 奇楠沉香茶中多酚类物质抑制超氧阴离子自由基的能力
以改良邻苯三酚自氧化的速率来表示抑制超氧阴离子自由基的能力[15]。
加入样品前：将pH 8.2 Tris-HCl缓冲液和50 mmol/L邻苯三酚在25 ℃的恒温水浴锅中保温，取5 mL pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，加30 μL 50 mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325 nm下立即测定。以pH 8.2 Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5 min测1次吸光度，计算出平均值A0。
加入样品后，取5 mL pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，加5～60 μL待测样品、30 μL 50 mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。以pH 8.2 Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5 min测1次吸光度，计算出平均值A1。按照加入样品的方法测出不加入邻苯三酚的吸光度，计算出平均值At。
式中：A1为加入待测物后吸光度；At为待测物的吸光度；A0为空白对照吸光度。
1.2.4 奇楠沉香茶中多酚类物质清除DPPH自由基的能力
1.2.4.1 DPPH标准曲线的绘制[16-17]
精密称取0.020 2 g DPPH，加甲醇溶解，定容至50 mL，作为储备液。精密移取10 mL储备液至100 mL量瓶中，定容得40.4 mg/L储备液，备用。分别精密移取0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL DPPH储备液于10 mL刻度试管中，用甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇溶剂作参比，在515 nm处测定各溶液的吸光度。以DPPH的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.4.2 沉香茶中多酚类物质及抗坏血酸（VC）清除DPPH自由基的能力
测定方法见参考文献[17-18]，稍作修改。分别在1.0 mL DPPH储备液中加入不同体积（5～160 μL）沉香茶样品待测液或VC溶液，用甲醇稀释至总体积3.00 mL，混匀放置40 min后，用比色皿于515 nm处测定吸光度A1；用同样操作步骤不加DPPH储备液测出沉香液在不同体积数下的吸光度At；由（A1-At）吸光度再根据DPPH标准曲线回归方程计算DPPH质量浓度，按式（3）计算DPPH清除率（Y）。
式中：C0为反应体系中DPPH的起始质量浓度，mg/L；Ct为40 min后反应体系中DPPH的质量浓度，mg/L。
2 结果与分析
2.1 奇楠沉香茶鞣质含量的测定
2.1.1 没食子酸标准曲线
以吸光度（y）对没食子酸质量浓度（x）回归，得到回归方程y=0.108 7x+0.003 1，所得没食子酸标准曲线如图1所示。
2.1.2 鞣质含量
以鞣质质量（总酚质量与不被吸附的多酚质量之差）与沉香叶质量的比值计算鞣质质量分数，见表1。
结果表明，奇楠沉香叶总酚含量仅0.017 1%；不被吸附多酚含量为0.015 9%；鞣质含量为0.001 2%。林芳花等[19]从广东省茂名市电白县沉香规范化种植基地沉香叶中测得鞣质含量为1.41%，这与试验测得的结果相差很大，原因可能是地方差异导致其含量相差很大，也有可能是试验提取不充分导致只有很低的鞣质含量。此外也说明沉香茶中含有的总酚与不被吸附多酚含量相差不大。
图1 没食子酸标准曲线
表1 鞣质含量
2.2 奇楠沉香茶中多酚类物质清除羟自由基的能力
依据Fenton反应体系建立的清除羟自由基能力，其结果如图2所示。
随着反应体系中沉香叶提取液增加，其清除羟自由基的能力逐渐增强。沉香茶提取液中多酚量0.412 μg/mL时，清除率最大，达到39.2%。但是其清除羟自由基的能力远不及VC。因此，云南西双版纳奇楠沉香茶提取液对羟自由基清除能力较弱，间接说明沉香茶中多酚类物质含量较低。
图2 清除羟自由基能力对比
2.3 奇楠沉香茶中多酚类物质抑制超氧阴离子能力
沉香茶多酚类物质与VC抑制超氧阴离子能力对比如图3所示。
沉香茶提取液中多酚类物质与VC一样，均具有一定抑制超氧阴离子自由基能力。随着提取液添加量增加，抑制超氧阴离子自由基能力不断加强，沉香叶提取液加入量0.14 mL时，沉香茶中的多酚抑制率达67.8%，与同等VC加入量的抑制效果相当。结果表明，云南西双版纳奇楠沉香茶提取液有抑制超氧阴离子自由基的能力，且到达一定量时效果显著。由此推断云南西双版纳奇楠沉香茶提取物有良好的体外抗氧化能力。
图3 抑制超氧阴离子能力对比
2.4 奇楠沉香茶中多酚类物质清除DPPH自由基的能力
2.4.1 DPPH标准曲线的绘制
配制DPPH标准溶液系列，绘制DPPH标准曲线，见图4。标准曲线线性回归方程为y=0.158 3x-0.004 0。
2.4.2 沉香茶中多酚类物质与VC清除DPPH自由基的能力
根据标准曲线，沉香茶中多酚类物质与VC清除DPPH自由基能力见图5。
随着反应体系中加入沉香叶提取物体积增多，其清除DPPH自由基的能力也加强，多酚含量0.091 μg/mL时清除能力达到最高水平，清除率达91.5%。与VC清除能力对比结果表明，在浓度很小时，VC清除DPPH自由基能力很强，而沉香茶中多酚类物质很低，当向溶液中加入一定量沉香茶待测液时，清除率有明显增大趋势，到一定量时，沉香茶待测液中多酚类物质清除DPPH自由基的能力接近VC，说明沉香茶中的多酚类物质有一定抗氧化能力，到一定程度时抗氧化能力良好。
图4 DPPH标准曲线
图5 清除DPPH自由基能力对比
3 结论
研究表明，用蒸馏水浸泡过夜后，经过超声处理提取沉香茶中的多酚类物质量相对较少，导致测出的鞣质含量较低。沉香茶中的多酚类物质总抗氧化的能力随加入量愈多，抗氧化能力愈强及清除羟自由基的作用愈强，并用VC进行对照，说明沉香茶中多酚类物质具有一定抗氧化及清除羟自由基能力；进一步采用DPPH法对沉香茶中多酚类物质进行体外抗氧化活性研究，与VC进行对比，更能说明沉香茶中多酚类物质具有抗氧化能力，但抗氧化能力相对于VC较差。试验结果为研究沉香茶的具体抗氧化性质提供基础。
