量子点标记荧光免疫法检测过氧化氢酶

2020-07-24李梦瑶王书雅谢云峰张修珂刘云国翟晨

食品工业 2020年7期

李梦瑶，王书雅，谢云峰，张修珂，刘云国，翟晨*

1. 新疆大学生命科学与技术学院（乌鲁木齐 830002）；2. 中粮营养健康研究院，营养健康与食品安全北京市重点实验室（北京 102209）；3. 临沂大学生命科学学院（临沂 276000）

过氧化氢酶（CAT），是生物体系的关键防御酶之一[1]。由CAT构成的酶保护系统可以消除植物细胞呼吸代谢产生的有害物质，具有使植物免受氧化胁迫、提高植物抗逆水平和光合效率、增强植物防御能力、延缓衰老等作用[2-4]。果蔬采摘后，其后熟到劣变过程本质是细胞呼吸代谢产物引起的氧化现象的发生。因此，CAT含量的变化是评判番茄等农副产品新鲜度的一个重要指标。CAT含量的检测多采用凝胶电泳法、免疫印迹法和考马斯亮蓝染色法等[5-7]。这些方法受主观因素影响较大，且操作繁琐、费时费力，不是一种理想的检测方法。因此亟需开发一种准确、灵敏的检测方法。

量子点（QDs）直径介于1～10 nm，是一种受激发后可产生荧光的微纳米材料[8]。作为一种新型荧光标记探针，具有高灵敏度、高荧光效率、独特的光学性能、生物兼容性好等多种优点[9,11]。基于量子点荧光标记免疫分析技术在微生物检测、农兽药残留、蛋白类毒素、重金属残留等方面得到广泛应用，但对于蛋白酶类的分析检测研究较少[10-15]。因此，试验利用量子点标记过氧化氢酶合成量子点-过氧化氢酶（QDs-CAT）荧光探针，建立过氧化氢酶免疫荧光分析检测的新方法，并对探针合成条件和检测条件进行优化，使得该方法具有较宽检测范围、低检测限和高灵敏度，通过番茄样品加标回收验证量子点标记荧光免疫法检测过氧化氢酶可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

F-7000型荧光分光光度计（日本Hitachi公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；Synergy Mx荧光酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

量子点（CdSe/ZnS，上海昆道生物科技有限公司）；过氧化氢酶、过氧化氢酶抗体（上海士峰生物科技有限公司）；1-乙基-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（国药集团化学试剂有限公司）；黑色96孔板（美国Corning公司）。

试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 量子点荧光探针制备

量取100 μL 1 mg/mL量子点至700 μL 25 mmol/L pH 6.0 PBS 缓冲液中，加入100 μL 3 mg/mL NHS和100 μL 2 mg/mL EDC溶液，超声分散均匀，置于30 ℃250 r/min恒温培养箱中反应30 min，于8 000 r/min的离心机中常温离心10 min，去掉上清液[16]。加入1 mL 100 μg/mL CAT抗原溶液复溶，超声分散均匀，置于37 ℃ 250 r/min恒温培养箱中避光反应1.5 h；反应结束后在10 000 r/min下离心10 min，去除上清液中游离的过氧化氢酶。加入1 mL pH 7.4的PBST溶液，超声分散均匀，在250 r/min，37 ℃摇床振荡1 h，取出，4 ℃储存备用。

1.2.2 荧光免疫检测方法的建立

用pH 7.4、0.01 mol/L PBS缓冲液对过氧化氢酶抗体进行稀释，以每孔100 μL加入酶标板中，4 ℃下包被过夜后，用含0.5%吐温-20的0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗涤3次并甩干，每孔加入250 μL的1% BSA，在37 ℃下对所述空白位点进行封闭1.5 h。洗板3次，每孔分别加入50 μL不同浓度的过氧化氢酶标准品溶液（样品液）和50 μL QDs-CAT探针溶液（PBS 稀释），在37 ℃下与包被在所述酶标板中的过氧化氢酶多克隆抗体进行竞争性地结合1 h[17]。洗涤3次并甩干，每孔加入100 μL PBS缓冲液，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗体-抗原发光免疫复合物的荧光强度，其中激发波长375 nm，检测波长622 nm。以一系列不同浓度的过氧化氢酶标准溶液中的过氧化氢酶的浓度为横坐标，所获得的荧光强度为纵坐标，绘制得到标准曲线。

1.3 方法学评价与应用

1.3.1 特异性试验

果蔬等样品的粗提液基质较为复杂，为了研究在最佳条件下其他物质是否会干扰酶的检测。试验在相同条件下，对样本中可能存在的干扰物质，如离子（NaCl、KCl、CaCl2）、维生素C、葡萄糖、氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）进行探究。

1.3.2 番茄样品加标回收和准确度试验

取新鲜的番茄，洗净晾干，于搅拌机中打碎10 min，冰浴状态下用研钵研磨至泥状。按料液比1∶2（g/g）称取一定量番茄泥，加入样品提取液（0.05 mol/L PBS缓冲液）在4 ℃高速离心机中以5 000 r/min进行离心30 min，取上清液作为样本溶液。进行超高温加热处理，致使样溶液中的过氧化氢酶失活，待其冷却至室温。添加过氧化氢酶标准品于样本溶液中，采用建立的方法对样本溶液进行分析。每份样本进行5次平行试验，并且连续3 d重复试验，计算每个样本的回收率以及批内、批间的变异系数[18]。

2 结果与分析

2.1 量子点-过氧化氢酶表征分析

由于量子点表面含有羧基官能团，其在活化剂NHS/EDC作用下，可与含有氨基的过氧化氢酶反应生成稳定的酰胺键。通过对偶联前后量子点的荧光强度进行比较（图1），发现偶联前后的发射波长的峰位置没有明显红移现象，且偶联过程对量子点的荧光信号影响较小[16]。因此QDs-CAT荧光探针可用于免疫检测。

2.2 参数优化

2.2.1 NHS/EDC添加量的确定

NHS/EDC的添加量会影响量子点的荧光强度和量子点与过氧化氢酶的偶联率。因此，保持其他试验条件不变情况下，改变NHS/EDC添加量，对合成QDs-CAT荧光探针按照1.2方法进行免疫荧光检测。结果表明（图2 A）NHS/EDC的添加量10 μL时，即NHS/EDC的浓度分别为3和2 μg/mL，荧光强度较高，表明偶联效果好且对量子点的荧光强度影响较小。

2.2.2 pH

体系的pH会影响过氧化氢酶的活性和量子点的荧光强度。在不同pH条件下，量子点与过氧化氢酶进行偶联合成反应，并对合成物进行免疫荧光分析。结果表明（图2 B）在pH 7.4时，过氧化氢酶与抗体存在较好的特异性结合且荧光信号相对较高。因此，选择pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为偶联反应的缓冲液。

2.2.3 抗体添加量

保持其他试验条件不变情况下，优化抗体添加量。结果如图2C所示，荧光信号值随着抗体浓度增加而增强，抗体浓度1 μg/mL时，荧光信号值达到最大；随着抗体浓度继续增加，荧光信号值降低。原因可能是空间位阻使得抗体与酶标板结合的稳定性降低，在洗脱过程中大部分抗体被洗脱，导致抗原抗体量结合物减少且荧光强度信号值减低。故初选抗体浓度1 μg/mL。

2.2.4 荧光探针QDs-CAT添加量

由于是采用竞争法对CAT进行检测，QDs-CAT荧光探针的添加量将直接影响试验结果。因此，通过抗体与含有不同浓度QDs-CAT荧光探针孵育，进行荧光检测，确定QDs-CAT最佳添加量。结果如图2D所示，荧光信号值随着QDs-CAT荧光探针添加量增加而增强，QDs-CAT添加量10 μg/mL时，荧光信号达到最值，继续增大QDs-CAT添加量，荧光信号值的强度基本不变。为了节约试验成本，选择10 μg/mL浓度的QDs-CAT进行试验研究。

2.2.5 BSA浓度的确定

封闭液能降低非特异性结合，提高检测灵敏度。试验在其他条件不变情况下，以未进行封闭处理的作为对照试验，由图2E可知，由于非特异性吸附导致荧光信号值较高；与对照孔相比，进行封闭处理的微孔中的荧光信号值显著降低。BSA封闭液的浓度≥1%时，其荧光信号值与对照孔的差异最明显。考虑到试验成本，因此确定选择1% BSA作为封闭液。

2.2.6 检测时间选择

孵育时间影响抗原抗体复合物的形成，且对试验的荧光信号值有重要的影响。因此，试验在其他条件不变的情况下，对孵育时间进行考察。由图2F可知，荧光信号值随着孵育时间增加而增强，在60 min时，荧光信号值达到最大，继续延长孵育时间，荧光强度变化不大，表明抗原抗体结合基本达到稳定，因此试验选择60 min作为抗原抗体孵育时间。

图1 量子点偶联前后荧光光谱图

图2 单因素试验结果

2.3 免疫荧光检测方法建立

在最佳反应条件下（pH 7.4 PBS中37 ℃反应60 min），考察探针对不同浓度的过氧化氢酶标准溶液（0，0.05，0.1，1，50，100，200，400，600，800和1 000 μg/mL）的荧光光谱信号的变化，如图3所示。

图3 过氧化氢酶的荧光光谱图和线性关系图

过氧化氢酶浓度在1～1 000 μg/mL的范围内，探针的荧光光谱信号呈现良好的线性关系，线性回归方程ΔF=0.593 7C+154.3（R2=0.994 2），式中：ΔF是探针在有无过氧化氢酶存在的条件下其荧光强度光谱信号的变化；C为过氧化氢酶浓度（μg/mL）。其最低检测限为2.5×10-2μg/mL。

2.4 特异性试验

试验空白对照孔荧光强度F0，含有不同种类离子（30 μmol/L的KCl、CaCl2、NaCl，15 mmol/L的维生素C（VC）、葡萄糖、丝氨酸、苏氨酸）和200 μg/mL的蛋白样本溶液的荧光强度F，以相对荧光强度ΔF（ΔF=F0-F）考察不同抗原对免疫检测荧光强度的影响[19-20]。如图4所示，含有CAT试样的荧光响应信号值较高，其它干扰物质的荧光强度都低于50，表明该方法有较好的选择专一性。

图4 干扰物的荧光响应信号图

2.5 样品加标回收和准确度试验结果

试验中对不同批次的番茄提取液进行了加标回收。采用所建立的方法进行检测，试验结果如表1所示。应用该方法检测得到的回收率＞90%，且批内、批间变异系数均＜15%，说明建立的方法准确度好，可应用于实际样品中CAT的检测。

表1 番茄中过氧化氢酶的添加回收率和变异系数

3 讨论

试验建立一种过氧化氢酶量子点荧光免疫检测方法。试验以荧光强度为指标，对荧光探针合成条件和免疫荧光分析检测条件等参数进行优化。在最佳条件下建立过氧化氢酶检测模型，方法线性范围为1～1 000 μg/mL，相关系数为0.994 2，最低检测限可达2.5×10-2μg/mL，并对番茄样品进行加标回收试验，结果表明该方法回收率高，且具有较好的稳定性和特异性。可以初步实现对过氧化氢酶的定量，为实际检测节省大量时间，适用于大样本快速检测，具有良好的应用前景。

量子点因其独特的光学性质，以及与蛋白质偶联技术日趋成熟，其在免疫分析中的应用也愈加广泛。量子点免疫荧光法与传统的ELISA和荧光方法相比，具有分析时间短、检测限低、步骤简单、可直观检测等优点，同时该方法也为用于其他蛋白酶类的定量荧光免疫检测提供参考。