离子液体均相液液微萃取荞麦中三嗪除草剂

刘娇娇，张晨曦，张雪，张悦，周萌，张丽媛

黑龙江八一农垦大学食品学院（大庆 163319）

食品中的农药残留问题是近年来被社会广泛关注的话题[1]。三嗪类除草剂，即分子结构中均含有三嗪环结构的化合物，被广泛用于大豆、玉米、水稻等农田杂草。这类除草剂会残留于土壤、农作物，甚至流入水体，最终进入农产品中。据报道，三嗪类除草剂残留可能会引起生物体生理的紊乱[2]，因此，这类除草剂在农产品中的残留及对环境造成的毒害越来越引起关注。Amalric等[3]在当地土壤中发现停用7年的莠去津及其代谢产物。在西班牙Salamanca和Zamora地区的地表水和地下水中，Carabias等[4-5]发现三嗪类除草剂残留。Wang等[6]测定10种谷物样品中该类除草剂残留，50%样品中检出残留物，残留量浓度在6～28 μg/kg之间。三嗪类除草剂的最大残留限量（MRL）被全世界范围内多数国家和地区制定[7-8]。美国环保署（EPA）和欧盟（EU，Commission Directive 2008/149/EC）分别规定蔬菜中的特丁津MRL为0.25和0.05 mg/kg。离子液体作为萃取溶剂或者起泡剂被广泛应用[9-13]，近来报道关于基于离子液体泡沫浮选萃取、分离和富集玉米中的三嗪除草剂[14]取得良好效果。

试验采用离子液体均相液液微萃取技术提取荞麦中三嗪除草剂。利用无机盐及酸去除样品中的蛋白质和脂肪等杂质。将亲水性离子液体和疏水性离子液体分别加入到溶液中得到均相浑浊液，高速离心后得离子液体富集相，高效液相色谱仪进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，配有多波长检测器、真空脱气机和Chemstation工作站（美国Agilent公司）；粉碎机（JFSD-100-Ⅱ，上海嘉定粮油仪器有限公司）；电子分析天平（ALC-310型，上海民桥科学仪器有限公司）；RE-52 AA型真空旋转蒸发仪（亚荣，上海，中国）；超声波清洗器（KQ 2200E，中国昆山仪器有限公司）；高速离心机（Allegre 64R，美国贝克曼公司）；纯水净化仪（Milli-Q，法国Millipore公司）；移液枪（Finnpipetter F3，赛默飞世尔科技公司）；微量注射器（美国Agilent公司）。

2种离子液体：1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C6MIM][BF4]）、1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐（[C4MIM][PF6]）（均为分析纯，上海成捷化学有限公司）。

特丁通（Terbumeton）、特丁津（Terbuthylazine）、异戊乙净（Dimethametryn）、异丙净（Dipropetryn）标准品（国家药物和生物制品控制研究所（北京），用甲醇配制浓度500 μg/mL的5种三嗪除草剂的单标储备液，每周用甲醇稀释单标储备液制备单标工作溶液；同样的方法稀释配制不同浓度混合标准工作溶液；所有标准贮备和工作溶液在4 ℃条件下避光储藏）；乙腈、甲醇（均为色谱纯，美国赛默飞世尔有限公司）；其他试剂均为国产分析纯；Milli-Q高纯水。

1.2 样品溶液的制备

荞麦购于当地超市并于4 ℃储存。取荞麦，粉粹，过80目筛子，每份称取3.00 g荞麦粉末，放入聚四氟乙烯管中，加入2 mL水，混合均匀，用浓度为50 g/L的NaCl溶液调pH 8，将60 μL的[C6MIM][BF4]和60 μL的[C4MIM][PF6]依次加入到样品溶液中，剧烈振荡，超声3 min，在-20 ℃的条件下保存15 min，10 000 r/min，温度5 ℃条件下高速离心10 min，分相，将上清液完全倾倒去除，为减少离子液体萃取剂的损失，把乙腈直接加入到萃取管底部稀释离子液体至250 μL。最终超声搅拌乙腈-离子液体混合相至均匀，用0.22 μm的聚四氟乙烯的滤膜过滤萃取相后，将其进入高效液相色谱仪进行检测。同样的方法制备加标样品溶液。

1.3 高效液相色谱法测定

色谱条件为C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相流量1.00 mL/min，进样体积10 μL，紫外检测波长228 nm。流动相为乙腈（A）和水（B）；梯度洗脱：0～5 min，40%～60% A；5～15 min，60%～80% A；15～20 min，80%～40% A。

2 结果与讨论

2.1 离子液体均相液液微萃取条件优化

在试验条件优化过程中，所有的试验进行3次平行样测定。

2.1.1 亲水性离子液体体积的优化

提高目标物富集率的关键是选择一种合适的水溶性和疏水性离子液体。根据文献[8]报道，在试验中选择[C6MIM][BF4]和[C4MIM][PF6]分别作为分散剂和萃取剂。[C4MIM][PF6]量固定为60 μL时，考察[C6MIM][BF4]体积对回收率的影响。离子液体体积由40 μL提高到60 μL时，目标化合物回收率随着离子液体体积增大而提高；离子液体体积由60 μL提高到80 μL时，回收率保持恒定。这主要是因为作为配合产物的[C6MIM][PF6]量不再随着离子液体体积增高而改变。因此，选择[C6MIM][BF4]体积60 μL。

图1 [C6MIM][BF4]体积的影响

2.1.2 [C4MIM][PF6]量的优化

考察疏水性离子液体对目标化合物回收率的影响。[C4MIM][PF6]量由40 μL提高到60 μL时，回收率明显升高；[C4MIM][PF6]量由60 μL上升到80 μL时，回收率没有发生改变。因此，选择疏水性离子液体量60 μL。

图2 疏水性萃取剂体积的影响

2.1.3 萃取温度的优化

为了使荞麦中三嗪类除草剂提取更快、回收率更高，需要对样品进行超声，超声温度分别为25，30，35，40和45 ℃，利用离子液体均相微萃取对样品溶液进行提取，进入高效液相色谱中进行分析，结果表明，超声温度35 ℃时除草剂的回收率最高。因此，超声温度定为35 ℃。

2.1.4 萃取时间的优化

理论上，萃取时间的提高有助于完善目标物在离子液体和水溶液之间的分配平衡，同时促进回收率提高。考察萃取时间对目标分析物回收率的影响。在1～5 min内，回收率随着萃取时间增长而迅速上升，时间3 min时，回收率达到最大值，而后恒定，可认为目标物在离子液体与水溶液之间已经分配平衡。因此，选择萃取时间3 min。

图3 超声时间的影响

2.2 方法评价

2.2.1 回归方程

对于一系列加标荞麦样品，在最佳试验条件下进行离子液体均相微萃取，用HPLC分析，根据液相色谱图上的峰面积与加标样品中的除草剂的浓度分别做方法工作曲线，其结果列于表1，用工作曲线来计算方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。LOD和LOQ均由式（1）和（2）得到。

式中：σ为由不含目标物的样品得到的分析溶液，为空白样品；c为方法工作曲线斜率。

表1 分析性能

2.2.2 精密度和回收率

为了评价方法的精密度和准确性，制备3个加标水平（0.5，1.0和5.0 μg/mL）的加标样品进行日内精密度和日间精密度的分析，日内和日间精密度以相对标准偏差（RSDs）表示。日内精密度是通过1 d之内平行测定3次加标样品所得到回收率的相对标准偏差。日间精密度是通过每天分析1次加标样品，连续分析3 d所得回收率的相对标准偏差。结果如表2所示。

2.2.3 样品分析

经过分析可知，所取荞麦样中不含待测的4种除草剂，在所取荞麦样中分别添加高、中和低浓度被测物混合标准溶液，用建立的方法提取荞麦样中的除草剂。方法的准确性用除草剂回收率衡量，其精确度用日内和日间精密度表示。由表2可知，4种三嗪除草剂的回收率在83.2%～98.1%之间，其精密度在1.6%～4.9%之间。对于大多数目标物的试验结果令人满意。其液相色谱图如图4所示，方法可用于分离富集分析荞麦中的三嗪除草剂，且无干扰。

表2 样品分析结果

图4 色谱图

3 结论

在分离检测荞麦样品中三嗪类除草剂残留的过程中，离子液体均相液液微萃取技术被成功地运用。与传统的分散液液微萃取技术不同，微量离子液体代替传统的挥发性有机溶剂作为提取剂，能够减少对环境和操作人员的危害；同时提高了离子液体的回收率。因此，可通过改变萃取条件，将方法运用于测定类似复杂基质样品中三嗪类除草剂的残留。