蒸汽闪爆处理对高温米糠粕美拉德反应的影响

那治国 ，王红梅，闫宝军，张岚，马永强*

1. 黑龙江东方学院食品与环境工程学部（哈尔滨 150066）；2. 哈尔滨商业大学食品工程学院（哈尔滨 150076）

米糠作为水稻制米的主要副产物，资源极其丰富，其中所含蛋白质不仅必需氨基酸组成合理，效价较高，而且具有低过敏性等优点，是一种极具开发潜力的植物蛋白资源[1-3]。然而，由于米糠蛋白溶解性低，提取困难，且蛋白纯度不高，尤其是高温米糠粕蛋白过度变性，结构更为复杂，极大限制其在食品工业中的应用，至今没有实现工业化生产[4]。这与米糠蛋白复杂的组成成分密切相关，米糠中含有37%清蛋白、36%球蛋白、22%谷蛋白与5%醇溶蛋白，而且这些蛋白具有较强的聚合和大量二硫键，溶解性很差[5]。另一方面，为了防止米糠油脂酸败而进行的热稳定化处理可导致蛋白严重变性，蛋白交联作用增加，结构更为复杂，溶解性等功能性质下降[6]。由于米糠中膳食纤维和植酸含量较高，加剧米糠组分间的相互聚结，使蛋白很难分离。

前期研究表明，蒸汽闪爆（SFE）处理可有效提高高温米糠粕中蛋白质的提取率和氮溶解指数[7]。这主要是由于蒸汽闪爆处理使物料同时受到高温蒸煮和蒸汽瞬间释放所产生的机械剪切作用，一方面可使米糠细胞壁结构破坏，半纤维素降解，包裹镶嵌其中的蛋白质被释放[8]；另一方面，这些作用势必会引起高温米糠粕中蛋白质分子结构、理化性质的变化，进而影响其溶解性等功能性质[9-10]。另外，根据美拉德反应的原理和特征可知，蒸汽闪爆过程中存在的高温蒸煮作用可能会引起高温米糠粕中的蛋白质与糖类物质共价结合，蛋白质分子极性增加，空间结构变化，溶解性等功能性质变化[11-12]。1988年Kato等[13]首次应用干热法对蛋白质进行糖基化改性，发现接枝物的溶解性、乳化性等功能特性均有很大改善，大量研究报道均证实蛋白质糖基化改性能在一定程度上改善其功能性质，但关于蒸汽闪爆对米糠粕美拉德反应的研究尚属空白。试验采用蒸汽闪爆技术对高温米糠粕进行处理，探讨蒸汽闪爆对米糠蛋白美拉德反应的影响，为进一步研究蒸汽闪爆对高温米糠粕中蛋白质结构和功能特性的影响提供理论基础，并为开发高温米糠粕中蛋白质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高温米糠粕（黑龙江省北大荒米业集团有限公司），米糠在130 ℃、30 min湿热稳定化处理后，脱脂制成的粉末，其蛋白质含量为18.23%，含水率10.3%。

2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS，美国Sigma-Aldrich公司）；L-赖氨酸（分析对照品，上海吉至生化科技有限公司）；浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、溴化钾、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、3, 5-二硝基水杨酸、葡萄糖（均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

QBS-80蒸汽闪爆机（鹤壁市正道生物能源有限公司）；EA3000全自动元素分析仪（意大利EuroVector仪器公司）；NR60CP手提式多功能色差仪（深圳市三恩时科技有限公司）；S433D全自动氨基酸分析仪（德国Sykam公司）；RF-5301PC荧光分光光度计（日本岛津公司）；TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪（德国BRUKER光谱仪器公司）；A11分析研磨机（德国IKA公司）；UDK152全制动凯氏定氮仪（意大利VELP公司）；X18A铝模块自动消化装置（上海晟声自动化分析仪器有限公司）；PDU-1100冷冻干燥机（日本东京理化公司）；T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 蒸汽闪爆处理

将高温米糠粕粉碎，过60目筛，取400 g米糠粕粉放入蒸汽闪爆机的处理腔中，通入一定压力的饱和蒸汽并保压一定时间，在极短时间（ms）内进行蒸汽闪爆处理，收集闪爆样品，-20 ℃保存备用。

1.3.2 米糠蛋白质的制备

称取一定量的蒸汽闪爆处理前后的高温米糠粕，按料液比1∶15加入蒸馏水混合，调节pH 9.0，在45℃水浴下搅拌浸提2 h后，以4 000 r/min离心15 min，收集上清液，20 ℃下调pH至4.6，静置30 min，以4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，蒸馏水洗涤沉淀2次，相同方法离心，用去离子水溶解沉淀，调节pH 7.0，冷冻干燥后得到米糠蛋白。

1.3.3 蛋白质得率、纯度的测定

采用mico-Kjeldahl法测定米糠蛋白中蛋白质含量，同时测定米糠粕中蛋白质含量，按式（1）计算蛋白质得率，按式（2）计算米糠蛋白纯度。

1.3.4 还原糖的测定

准确称取一定量蒸汽闪爆处理前后的高温米糠粕，采用3, 5-二硝基水杨酸（DNS）法[14]测定还原糖含量。

1.3.5 氮元素和碳元素的测定

采用意大利Euro Vector EA3000全自动元素分析仪测定米糠蛋白中氮元素和碳元素含量。

1.3.6 米糠蛋白色泽的测定

采用手提式多功能色差仪测定米糠蛋白的色差值L*，a*，b*。

1.3.7 自由氨基的测定

参考Lertittikul等[15]的方法测定。称取一定量米糠蛋白样品，溶于0.1 g/100 mL SDS溶液中，配制质量浓度0.2 g/100 mL的蛋白质溶液。取0.4 mL蛋白质溶液，加入2 mL pH 8.2的磷酸盐缓冲溶液和1 mL 0.1 g/100 mL TNBS试剂，振荡混匀，在50 ℃水浴中避光反应1 h后，加入2 mL 0.1 mol/L HCl终止反应，室温下放置30 min后，以蒸馏水为空白，420 nm下测定吸光度。以L-赖氨酸制作标准曲线，计算样品中自由氨基含量。

1.3.8 氨基酸组成分析

精确移取一定量米糠蛋白样品于水解管中，加入一定量的6 mol/L HCl溶液，密闭，110 ℃下水解24 h，冷却，定容，过滤，干燥，加入一定量的0.02 mol/L HCl溶液，真空下放置30 min后加入氨基酸自动分析仪测定除色氨酸以外的其他氨基酸含量。

1.3.9 傅里叶红外光谱（FTIR）分析

参考齐军茹等[16]的方法测定。准确称取适量干燥后样品，加入一定量溴化钾，研磨成均匀的粉末，压成薄片，采用TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪作全波段（4 000～500 cm-1）扫描，扫描32 次。

1.3.10 荧光光谱分析

参考Li等[17]的方法测定。分别取各米糠蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0、0.01 mol/L），配置成1.0 mg/mL的溶液。荧光光谱的激发波长为340 nm，发射光谱扫描范围为360～510 nm，激发和发射狭缝宽均为5 nm，扫描速度10 nm/s。

1.3.11 数据统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均值±SD。数据统计分析采用SPSS 13.0软件（p＜0.05表示差异显著，p＞0.05表示差异不显著）。傅里叶红外光谱和荧光光谱采用Origin 8.0软件作图，其他采用Microsoft Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 高温米糠粕中还原糖含量变化

有研究表明，蒸汽压力0.9～2.1 MPa、保压时间90～210 s时，蒸汽闪爆处理高温米糠粕能有效提高米糠蛋白的氮溶解指数[7]。因而，选择0.9，1.5和2.1 MPa这3个蒸汽压力，在90，150和210 s的保压时间下进行蒸汽闪爆，处理后的高温米糠粕分别表示为：HTDDRB-0.9-150、HTDDRB-0.9-210、HTDDRB-1.5-90、HTDDRB-1.5-150、HTDDRB-2.1-90、HTDDRB-2.1-210，未处理的高温米糠粕标记为RHTDDRB，制备的米糠蛋白分别标记为RBPI-0.9-150、RBPI-0.9-210、RBPI-1.5-90、RBPI-1.5-150、RBPI-2.1-90、RBPI-2.1-210，未处理的高温米糠粕制备的米糠蛋白标记为RBPI。

图1为不同蒸汽闪爆条件处理后高温米糠粕中还原糖含量变化。未处理的高温米糠粕（RHTDDRB）中的还原糖含量仅2.44%，蒸汽闪爆处理后还原糖含量显著（p＜0.05）上升，且受蒸汽压力和保压时间影响较大，在2.1 MPa、210 s条件下，还原糖含量增至6.28%，与RHTDDRB相比提高1.57倍。有研究表明蒸汽闪爆可使米糠中的纤维组分在蒸汽蒸煮和机械剪切作用下部分降解为低分子的糖类[8]，从而导致高温米糠粕中的还原糖含量上升。

图1 蒸汽闪爆对高温米糠粕中还原糖含量的影响

2.2 米糠蛋白得率、纯度及氮碳元素含量变化

表1为高温米糠粕经不同蒸汽闪爆处理后，所得米糠蛋白的得率、纯度及氮元素和碳元素含量的变化情况。未经蒸汽闪爆的高温米糠粕制备的米糠蛋白的得率仅27.42%，而经蒸汽闪爆处理后蛋白质得率显著升高（p＜0.05），最高可升至48.61%（RBPI-2.1-210）；且蛋白质得率受蒸汽压力影响显著（p＜0.05），压力从0.9 MPa上升到1.5 MPa时蛋白质得率从35.23%（RBPI-0.9-150）提高到45.86%（RBPI-1.5-150），提高30.17%，压力从1.5 MPa上升到2.1 MPa时蛋白质得率从41.42%（RBPI-1.5-90）提高到46.50%（RBPI-2.1-90），提高了12.27%；同时发现在低压下蛋白质得率随保压时间的变化较大，在0.9 MPa下保压时间从150 s升到210 s，蛋白质得率提高10.28%，而在高压下蛋白质得率随保压时间的变化较小，在2.1 MPa下保压时间从90 s升到210 s，蛋白质得率仅提高4.54%。

从表1中可以发现，高温米糠粕经蒸汽闪爆后制备的蛋白的纯度显著下降（p＜0.05），最高降幅为10.27%（从83.65%降到75.06%），并且随着蒸汽压力的升高蛋白质纯度有所下降，保压时间为210 s时蒸汽压力从0.9 MPa上升到2.1 MPa，蛋白纯度78.13%降至75.06%。结合蛋白质得率的变化，可以发现，蒸汽闪爆处理虽然使蛋白纯度下降，但蛋白质的得率可以显著增加（p＜0.05），同时在较高蒸汽压力较短保压时间（RBPI-2.1-90）和较低蒸汽压力较长保压时间（RBPI-1.5-150）下，蛋白质得率和纯度变化均较小。

米糠蛋白纯度的降低表明米糠蛋白中所含有的非蛋白质类物质增多[18]。因此，进一步对米糠蛋白所含的氮元素和碳元素进行测定，以探究蒸汽闪爆使蛋白纯度降低的原因。从表1中的氮元素和碳元素含量变化中可以看出，高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后的米糠蛋白中氮元素含量显著降低（p＜0.05），最高降幅26.65%（由15.27%降至11.20%），而碳元素的含量显著增加（p＜0.05），最高升幅15.18%（由46.30%降至53.33%），且受蒸汽压力和保压时间的影响均较大。表明蒸汽闪爆处理后，米糠蛋白中氮元素含量较多的成分（如蛋白质）相对降低而碳元素含量较高的成分（如糖类）相对升高，这可能是由于蒸汽闪爆过程中，高温米糠粕中的蛋白质与糖类物质发生美拉德反应，蛋白质分子中引入糖链，进而使得蛋白中碳元素增加而氮元素相对降低，且米糠蛋白纯度降低。

表1 不同蒸汽闪爆处理条件下米糠蛋白的分析 %

2.3 米糠蛋白色泽变化

不同蒸汽闪爆处理前后的米糠蛋白的色差值L*，a*，b*见表2。高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后制备的米糠蛋白的L*值显著降低（p＜0.05），最大降幅为35.58%，表明米糠蛋白的亮度降低，同时a*值显著升高（p＜0.05），最高上升25.00%，表示红色增加，且b*值显著降低（p＜0.05），表示黄色降低，而蓝色增加。米糠蛋白亮度（L*）的降低和红色（a*）的增加表明蒸汽闪爆处理过程中发生了非酶褐变，即：美拉德反应或焦糖化反应，而焦糖化反应主要是由还原糖等低分子糖引起，淀粉等多糖不易发生焦糖化反应[19]，由此可以判断米糠蛋白的色泽变化很可能是由高温米糠粕中的糖类物质和蛋白质在蒸汽闪爆的作用下发生了美拉德反应，生成黑色的美拉德反应产物所引起的[20]。

表2 不同蒸汽闪爆处理条件下米糠蛋白的色泽

2.4 自由氨基分析

高温米糠粕中除了含20%左右的蛋白质外，还含有膳食纤维、淀粉、低聚糖（棉籽糖、水苏糖等）及还原糖等糖类物质，在高温作用下极易发生美拉德反应，而美拉德反应主要是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基和糖分子还原末端的羰基之间的羰氨反应[21]，归属于糖基化反应。因而可通过分析米糠蛋白中自由氨基含量的变化来判断蒸汽闪爆过程中是否伴有美拉德反应的发生。

研究发现，蒸汽压力和保压时间对米糠蛋白得率、纯度、氮碳元素组成及色泽的影响较大，因此后续试验选择一个低压长时（0.9 MPa、210 s）、一个高压短时（2.1 MPa、90 s）和一个高压长时（2.1 MPa、210 s）的蒸汽闪爆处理条件下所得米糠蛋白为研究对象，与未经蒸汽闪爆的高温米糠粕制备的米糠蛋白进行对比，研究蒸汽闪爆对高温米糠粕中蛋白质的自由氨基、氨基酸组、傅里叶红外光谱和荧光性质的影响。

图2为不同蒸汽闪爆条件下所得米糠蛋白的自由氨基含量的变化情况。高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后，其米糠蛋白的自由氨基酸含量与未经处理的米糠蛋白（RBPI）相比显著下降（p＜0.05）。RBPI-0.9-210与RBPI-2.1-90的自由氨基含量相差不显著（p＞0.05），而RBPI-0.9-210与RBPI-2.1-210，RBPI-2.1-90与RBPI-2.1-210的自由氨基含量具有显著差别（p＜0.05）。表明蒸汽压力和保压时间对米糠蛋白的自由氨基含量影响较大，自由氨基含量随蒸汽压力的增大和保压时间的延长而下降，其中，RBPI-2.1-210的自由氨基含量最低为0.47 mmol/g，与RBPI的自由氨基含量（0.75 mmol/g）相比降低37.33%。另外，低压长时和高压短时的蒸汽闪爆条件对米糠蛋白自由氨基含量的影响不大。根据美拉德反应原理，米糠蛋白自由氨基含量的减少表明高温米糠粕中的蛋白质与糖类物质发生共价结合，形成美拉德反应产物，进一步验证米糠蛋白的纯度、氮碳元素组成及色泽变化的结果。Zhang等[22]研究发现豆粕经蒸汽闪爆处理后，所得米糠蛋白中的自由氨基显著降低，引发了糖基化反应；Xia等[23]在采用喷射蒸煮处理制备高温米糠分离蛋白的研究中，发现处理后的米糠蛋白自由氨基明显减少，与试验结果一致。

2.5 氨基酸组成分析

由试验可知，蒸汽闪爆处理过程可促使高温米糠粕中的蛋白质与糖类物质发生美拉德反应，造成米糠蛋白中的自由氨基减少。蛋白质的自由氨基包括末端的α-氨基和侧链的ε-氨基，为进一步研究糖类物质与米糠蛋白的结合部位，对不同蒸汽闪爆处理条件下制备的米糠蛋白进行氨基酸组成分析，结果见表3。

结果表明，蒸汽闪爆处理后米糠蛋白中的精氨酸和赖氨酸含量与未处理的对照样相比显著降低（p＜0.05），Xia等[23]在采用喷射蒸煮处理米糠粕的研究中发现，处理后的米糠蛋白的精氨酸和赖氨酸含量显著降低，表明精氨酸和赖氨酸可能参与美拉德反应，Guan等[24]在研究微波合成大豆蛋白—糖接枝物时也得出同样结论。由于精氨酸和赖氨酸的侧链上存在自由氨基，可以与糖类物质发生美拉德反应，可以确定米糠蛋白中的精氨酸和赖氨酸在蒸汽闪爆的作用下与糖分子发生美拉德反应，使其含量降低。由表3还可发现，精氨酸和赖氨酸的含量随着蒸汽压力和保压时间的升高而降低，在蒸汽压力0.9 MPa时精氨酸和赖氨酸含量分别为10.56%和3.57%（RBPI-0.9-210），而在蒸汽压力提高到2.1 MPa时其含量分别降为9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），同时在较高蒸汽压力下（2.1 MPa）精氨酸和赖氨酸含量随保压时间的延长而降低，由9.66%和3.12%（RBPI-2.1-90）降到9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），表明蒸汽闪爆处理时高压和长时有利于精氨酸和赖氨酸参与美拉德反应。

表3 不同蒸汽闪爆处理条件下米糠蛋白的氨基酸组成g/100 g蛋白质

2.6 傅里叶红外光谱（FTIR）分析

傅里叶红外光谱（FTIR）除了可用于蛋白质二级结构的分析外[25]，经常被用于美拉德反应产物的分析[26]。蛋白质与糖类物质发生共价结合即美拉德反应，可使蛋白质分子引入糖链，羟基增多，因而在3 700～3 200 cm-1（O—H和N—H的伸缩振动峰）和1 260～1 000 cm-1（—C—O—O糖苷键的伸缩振动）处的红外吸收增强[26]。对米糠蛋白进行傅里叶红外光谱扫描，结果如图3所示。

图3 不同蒸汽闪爆处理条件下米糠蛋白的傅里叶红外光谱

高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后，其米糠蛋白在3 700～3 200 cm-1处的红外吸收增强，其中，3 427 cm-1处的吸收强度增加最为显著，同时1 260～1 000 cm-1处的吸收也明显增加，并且增加的幅度受蒸汽压力和保压时间的影响较大，在2.1 MPa、210 s蒸汽闪爆条件下增加最为显著。表明高温米糠粕经蒸汽闪爆后，其蛋白分子上引入糖苷键，羟基增加，这进一步证明蒸汽闪爆过程中米糠蛋白质共价结合糖类物质，生成美拉德反应产物。

2.7 美拉德反应产物荧光光谱分析

美拉德反应产生的褐色物的前体物质具有典型的荧光特征，可作为美拉德反应的指示剂[27-28]，因此可通过米糠蛋白糖基化产物的荧光强度和光谱特征来研究美拉德反应的程度。美拉德反应产生的荧光物质的激发波长一般为340～370 nm，最大发射波长一般为420～440 nm。采用340 nm作为激发波长，对蒸汽闪爆处理前后制备的米糠蛋白进行扫描，结果如图4所示。

高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后制备的米糠分白的荧光光谱的最大发射波长和荧光强度都发生较大变化。原高温米糠粕制备的蛋白在440 nm处有最大荧光强度，而不同条件的蒸汽闪爆处理后，所得米糠蛋白分别在422，430和430 nm处有最大荧光强度，符合美拉德反应产物的荧光特征，且荧光强度均大幅度提高，进一步证实蒸汽闪爆处理过程中美拉德反应的发生。

从图4中还看出，随着蒸汽压力增加或保压时间延长，米糠蛋白的荧光强度明显减弱，这主要与美拉德反应的进行程度有关。研究发现，荧光物质是类黑素的前体物，且荧光物质所需要的诱导时间较短[17]，因此当蒸汽压力增大或保压时间延长时，会有更多前期产生的荧光物质转变为颜色物质，使荧光强度降低。因此蒸汽压力和保压时间可影响美拉德反应进程，这也可从米糠蛋白颜色变深得到验证（见表2）。

图4 不同蒸汽闪爆处理条件下米糠蛋白糖基化产物荧光光谱图

3 结论

蒸汽闪爆处理可显著提高高温米糠粕中的还原糖含量和蛋白质得率，但同时蛋白纯度出现不同程度降低，通过氮碳元素分析发现，其碳元素相对含量增加，米糠蛋白中引入碳元素含量较高的物质。蒸汽闪爆处理后所得米糠蛋白的色泽变深变暗，蛋白质的自由氨基及精氨酸和赖氨酸相对含量显著下降，傅里叶红外光谱显示蛋白质分子上引入糖苷键，表明高温米糠粕经蒸汽闪爆处理后，蛋白质中精氨酸和赖氨酸的自由氨基与糖分子的游离羰基发生美拉德反应，荧光光谱分析证实美拉德反应产物的存在，且反应进程受蒸汽压力和保压时间的影响显著。