花生根中白藜芦醇的提取与含量测定

叶梦娜，冯杉，刘晓敏，张娟，肖炯昌，马琳*

1. 天津中医药大学（天津 301617）；2. 北京中医药大学东方学院（廊坊 065001）

白藜芦醇（又名芪三酚），化学名为3, 5, 4-三羟基二苯乙烯（3, 5, 4-trihydrolystilbene），是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，其具有抗菌、抗氧化、抗自由基、抗癌、预防心脏病、抗血小板凝集、保护肝脏、防辐射、降血脂、抗诱变、抗艾滋病等生理活性[1-3]。大量研究表明花生资源，尤其是根的开发利用将是白藜芦醇的重要植物资源。我国花生资源极其丰富，是世界花生产量最高（占世界总产量的1/3）且出口最多的国家。常年种植面积466.7万 hm2左右，总产量约占全球2/5[4]，花生的根和茎作为花生收获后的废弃物，在农村基本用作动物的饲料或燃料。但其中白藜芦醇含量相当高，特别是花生根，其白藜芦醇含量是花生仁的数十甚至数百倍，更是葡萄酒中含量的数百倍[5]。研究了花生根中白藜芦醇提取工艺，以期为花生根的合理开发利用和天然白藜芦醇原料的工业化提取提供参考与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材料

试验材料为“阜花”系列品种花生的根，2015 年7月收集于辽宁省新民市，清水洗净，低温烘干，粉碎，过40目筛后备用。

1.1.2 仪器与设备

FW80高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；标准筛（浙江上虞市道墟五四仪器厂）；JD200-3G型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；JD60-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；电子调温电热套（北京科华实验仪器有限公司）；Agilent1100高效液相色谱仪，VWD检测器（G1314A），四元泵（G1311A）（美国Agilent公司）。

1.1.3 试剂

对照品白藜芦醇（2015年购自天津士兰科技有限公司），对照品纯度≥98%。乙醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 花生根中白藜芦醇的提取

准确称取一定量粉碎后的花生根试验材料，放入圆底烧瓶中，料液比1∶15（g/mL），加入70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1 h，过滤，3份滤液分别保存。

1.2.2 花生根中白藜芦醇的测定

分别从3份滤液中各取1 mL，离心后HPLC测定提取液中白藜芦醇含量。离心条件为：10 000 r/min，10 min，15 ℃。HPLC色谱条件为：色谱柱为Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B）。洗脱条件为：乙腈-水（30∶70，V/V），检测波长305 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

1.2.3 标准曲线的绘制

吸取一定量的白藜芦醇对照品原溶液，配制成425，850，1 700，3 060，6 290和13 000 ng/mL的对照品溶液，分别精密吸取各浓度对照品溶液20 μL，依次注入高效液相色谱仪，平行进样3次，以各成分的峰面积平均值为横坐标（X），其对照品溶液浓度（ng/mL）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，如图1所示。结果表明，白藜芦醇在8.5～260 ng范围内线性关系良好，其回归方程为Y=0.003X+94.89（r=0.999 6）；以HPLC法来确定花生根中白藜芦醇的提取量。

图1 白藜芦醇对照品标准曲线

2 结果与分析

2.1 花生根中白藜芦醇提取工艺参数的优化

采用常规的正交试验研究花生根中白藜芦醇的提取工艺条件，正交试验设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验设计方案L9(33)

表2 正交试验结果

由试验结果分析得知，乙醇体积分数是最主要因素，其次是提取时间，最后是料液比。3个因素的水平组合A2B2C3为此次试验的最优水平组合，即花生根中乙醇提取白藜芦醇的最优工艺条件为70%乙醇，料液比1∶15（g/mL），提取时间1 h。

2.2 花生根白藜芦醇提取次数的考察

按1.2.1提取方法，准确称取10 g粉碎后的花生根，放入圆底烧瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入70%乙醇溶液，回流提取5次，每次1 h，过滤，滤液分别保存。按1.2.2测定方法对花生根中白藜芦醇含量进行测定。进行3次平行试验，白藜芦醇含量测定结果见表3。

表3 不同提取次数下白藜芦醇含量测定结果μg/g

2.3 花生根中白藜芦醇的含量

花生根中白藜芦醇的提取及测定分别按试验方法1.2.1和1.2.2操作，准确称取200 g粉碎后的花生根试验材料，放入圆底烧瓶中，按料液比（1∶15）加入3 000 mL 70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1 h。平行试验10次，结果见表4。

表4 试验材料花生根中白藜芦醇含量测定结果 μg/g

3 讨论与分析

3.1 花生根白藜芦醇提取次数及吸收波长的确定

由表3可知，随着提取次数的增加，白藜芦醇提取率虽有所增加，但提取率增加不明显。由3次平行试验结果可知，提取次数为4次时，与提取次数为3次相比，平均增加1.1%；提取次数为5次时，与提取次数为3次相比，平均增加0.2%；由试验结果可知，花生根白藜芦醇提取次数为3次时最佳。HPLC法测定白藜芦醇含量，流动相为乙腈-水（30∶70，V/V）时，检测波长在305 nm处吸收峰面积大且峰形较好；另外，取白藜芦醇甲醇标准液，以甲醇为参比，用紫外分光光度计在200～900 nm波长间扫描，该标准品在305 nm处有最大吸收峰，故白藜芦醇检测波长确定为305 nm。

3.2 花生根白藜芦醇含量说明

为了验证提取方法的可行性和稳定性，采用得到的最佳提取方法，平行进行10次试验，由表4可知，10次试验，花生根中白藜芦醇的含量在0.044 7～0.050 1 mg/g之间，平均含量为0.047 3 mg/g。表明提取方法具有较好的稳定性。相关研究表明花生种子中白藜芦醇含量为0.02～1.79 μg/g[6]，花生根中白藜芦醇含量最高可达1.33 mg/g[5]。试验所得结果，白藜芦醇含量偏低，分析原因可能为以下两点：①研究表明[7-9]，花生的根、茎、花、果壳、种衣5个部位中含有白藜芦醇，其中花生根中含量最高，花生叶、花生胚乳中没有检测到白藜芦醇。研究的试验材料除根外，还包含有一定量的花生茎，这可能导致所提取的白藜芦醇含量偏低；②有研究表明在对花生根提取白藜芦醇前，用纤维素酶对花生根进行酶解预处理，酶解后的花生根与没有酶解的花生根相比，白藜芦醇的提取条件有明显差别，酶解后的花生根提取时间短，提取所需温度低，乙醇用量少，其原因为纤维素酶能酶解花生根的细胞壁，使白藜芦醇能更容易溶出，同时能使白藜芦醇苷酶解成白藜芦醇。研究在提取白藜芦醇前，没有使用纤维素酶对花生根进行酶解预处理，这也可能导致提取的白藜芦醇含量偏低。

3.3 讨论

研究在验证花生根中白藜芦醇提取方法的可行性和稳定性的过程中，有目的地称取较大量的花生根试验材料（200 g），平行进行10次试验，是想更好地模拟从花生根中大量提取白藜芦醇的可行性，结果表明提取方法具有较好的可行性和稳定性。我国每年花生收获后都会剩余大量的花生根，作为花生收获后的废弃物，在农村基本用作动物的饲料或燃料。

4 结论

我国每年花生收获后都会剩余大量的花生根，作为花生收获后的废弃物，在农村基本用作动物的饲料或燃料。研究表明花生根中白藜芦醇含量较高，是一个值得重视的天然白藜芦醇来源。对花生根中白藜芦醇的提取工艺条件进行了正交试验、提取次数考察，确定了花生根中乙醇提取白藜芦醇的最优工艺条件：70%乙醇，料液比1∶15（g/mL），提取时间1 h，并验证了提取方法的可行性和稳定性。此次研究中白藜芦醇的提取及测定方法，可为花生资源的进一步开发利用和花生根中白藜芦醇的工业化提取提供参考依据。