虾壳酱油制曲条件研究

舒亦雄，徐秀芬，李登，杨文君，段杉

(华南农业大学 食品学院 广东省功能食品活性物重点实验室广东省天然活性物工程技术研究中心，广州 510642)

我国是世界上对虾产量最大、消费量最多的国家，我国的虾养殖以南美对虾为主，主要是对外出口虾仁[1]。加工虾仁后，产生大量虾壳、虾头和其他废弃物，占整虾的30%～40%。这些虾头、虾壳废弃物除了富含蛋白质、虾青素、脂肪酸和多种氨基酸等营养成分外[2]，还含有钙、钾、钠、镁等常量元素和铁、锌、铜、锰、硒、钴、镍7种人体必需的微量元素[3]。目前我国虾副产品没有得到有效的利用，如何科学开发虾废弃物资源，提高其经济价值，已成为目前亟待解决的问题。酱油是我国传统的调味品，深受人们的喜爱，近年来酱油产销量逐年增加[4]。但是随着黄豆等原材料价格的上涨，酱油的成本增加，寻找新的原料代替[5,6]、提高原料的利用率、增强产品的风味、提升酱油产品的附加值成为研究的迫切需求。目前最常用的酱油原料是黄豆，其中的蛋白质含量为38.45%[7]，而虾壳中蛋白质含量约为20%～40%[8]，且氨基酸种类齐全，尤其富含鲜味氨基酸[9]，在发酵调味品方面应用潜力巨大[10]，可以作为海鲜酱油的原料。本文模仿大豆酱油的制曲工艺，以虾壳和面粉为原料，接种米曲霉制曲，摸索制曲工艺条件，为进一步酿造酱油奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

南美白对虾(Penaeusvannamei)的虾壳：购于湛江；米曲霉沪酿3.042：购于沂水锦润生物科技有限公司；面粉：购于滨州中裕食品有限公司。

1.2 仪器与设备

DK-8D型电热恒温水槽 上海森信试验仪器有限公司；SW-CJ-1FDA 型超净工作台 苏州安净净化技术有限公司；101-1型电热鼓风干燥箱 上海沪南科学仪器有限公司；Climace 11404人工气候箱 广州市科启生物科技有限公司；紫外分光光度计 上海安亭科学仪器总厂；JA2003电子天平 上海精密科学仪器有限公司；LDZX-40B型立式自控电热蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 制曲工艺流程

1.3.2 工艺说明

取南美白对虾的虾壳烘干后粉碎，混匀。取适量虾壳按照一定比例(W/W)加入面粉，然后加入一定量70 ℃蒸馏水混匀，静置1 h后于高压锅100 ℃灭菌。取出曲料并于室温冷却至30 ℃，接种米曲霉(Aspergillusoryzae)曲精。将上述接种后的曲料置于塑料筐中，塑料筐事先用灭菌的湿纱布(4层，纱布润湿不滴水)覆盖底部和表面。将曲料置于温度为30 ℃、湿度为90%的恒温恒湿培养箱中培养46 h，于制曲12 h进行第1次翻曲，于制曲19 h进行第2次翻曲。

1.3.3 单因素试验

选取虾壳粉碎程度、原料配比、润水量、蒸料时间、制曲时间、翻曲次数和接种量7个单因素，根据表1中的因素水平和1.3.2的方法制曲，观察成曲的感官质量并测定成曲的理化指标。考察以上7个单因素对成曲中感官质量、蛋白酶活力、糖化酶活力、水分含量、孢子数的影响。

表1 单因素试验因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.4 制曲工艺条件优化

在单因素试验的基础上进行正交试验，设计三因素三水平正交试验。

1.3.5 测定方法

水分含量按照GB/T 22906.3-2008 中烘箱干燥法测定，蛋白酶活力按照QB/T 1803-1993中福林酚法测定，糖化酶活力按照QB/T 1803-1993 中方法测定，孢子数按照SB/T 10315-1999中方法测定。

2 结果与分析

2.1 虾壳粉碎程度对成曲品质的影响

虾壳粉碎程度对成曲感官质量的影响见表2。

表2 虾壳粉碎程度对成曲感官质量的影响Table 2 Effect of shrimp shell crushing degree on sensory quality of finished koji

图1 虾壳粉碎程度对成曲中水分含量、孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响Fig.1 Effect of shrimp shell crushing degree on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

由表2和图1可知，随着粉碎程度的增加，成曲中孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力降低，水分含量增加。这可能是随着原料虾壳进一步粉碎，润水后易发生黏连、结块，在蒸料时会出现蒸料不均的现象，导致制曲时不通风和感染杂菌，抑制米曲霉的生长，从而影响酶系的分泌。当虾壳粉碎至约蚕豆大小时，其成曲中中性蛋白酶活力和糖化酶活力较高，且成曲中孢子数最高。原料虾壳需适度粉碎，当虾壳不粉碎时，米曲霉的生长繁殖面积变小，进而酶活降低，适当粉碎后的虾壳制曲有利于米曲霉的生长发育，因此粉碎大小以蚕豆大小为宜。

2.2 原料配比对成曲品质的影响

虾壳和面粉配比对曲料感官质量的影响见表3。

表3 虾壳和面粉配比对曲料感官质量的影响Table 3 Effect of the ratio of shrimp shells to flour on sensory quality of finished koji

由表3和图2可知，随着虾壳和面粉比例的减少，成曲中蛋白酶活力、糖化酶活力和孢子数量逐渐降低，水分含量逐渐上升。中性蛋白酶活力和糖化酶活力在原配料比(虾壳∶面粉)为10∶4时达到最大值，分别为2047.6，2018.3 U/g，且在该条件下曲料中的米曲霉孢子数最高和水分含量最低，说明该状态下，米曲霉生长情况较好，从曲料外观也可以看出，成曲表面孢子浓密，均匀丛生。在制曲过程中，虾壳和面粉提供米曲霉生长所需的营养成分，面粉提供米曲霉生长所需的碳源，随着面粉原料的减少，米曲霉的生长受到影响，只有在适度的原料比中，有充足的碳源和氮源米曲霉才能迅速增长繁殖，有利于成曲中酶系的形成，因此原料配比(虾壳∶面粉)以10∶4为宜。

图2 虾壳和面粉配比对成曲中水分含量、孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响Fig.2 Effect of the ratio of shrimp shells to flour on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.3 润水量对成曲品质的影响

润水量对曲料感官质量的影响见表4。

表4 润水量对曲料感官质量的影响Table 4 Effect of water additive amount on sensory quality of finished koji

续 表

由表4和图3可知，成曲曲料中的孢子数、中性蛋白酶活力、糖化酶活力随着润水量的增加先上升后降低。这是因为适当润水使原料中的蛋白质和淀粉在蒸料时变性和糊化，有利于米曲霉吸收营养物质，并提供米曲霉生长所需的水分。李幼筠等报道润水量过多，容易导致原料中的蛋白质在蒸料时过度变性，从而使曲料结块，不通风且高湿环境下易感染球菌，消耗淀粉原料，同时部分蛋白质原料被分解，产生氨味等不良气味，影响米曲霉的生长。成曲中孢子数和糖化酶活力在润水量为80%时均达到最大值，分别为5.95×108CFU/g和741.504 U/g值，对此时曲料表面孢子浓密均匀丛生，有浓郁曲香。在润水量大于80%时，成曲中的孢子数、中性蛋白酶活力、糖化酶活力均呈下降趋势。因此，润水量以80%为宜。

图3 润水量对成曲中水分含量、孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响Fig.3 Effect of water additive amount on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.4 蒸料时间对成曲品质的影响

蒸料时间对曲料感官质量的影响见表5。

表5 蒸料时间对曲料感官质量的影响Table 5 Effect of materials steaming time on sensory quality of finished koji

由表5和图4可知，中性蛋白酶活力随着蒸料时间的增加变化无显著性差异(p>0.05)，成曲中孢子数和糖化酶活力在蒸料20 min时均达到最大值，分别为5.12×108CFU/g和755.7 U/g。当蒸料5 min时，原料中蛋白质开始变性，随着蒸料时间的增长，适度变性的蛋白质增多，蛋白质的适度变性有利于米曲霉的生长和酶系的产生，蒸料时间过长时，原料中蛋白质发生过度变性[11]，形成不能被酶解的结构，同时糖类和一些含氨化合物发生褐色反应生成色素，影响米曲霉的生长繁殖，因此当蒸料时间达到20 min以后，糖化酶活力、中性蛋白酶活力、孢子数均下降。综上，蒸料时间以20 min为宜。

2.5 制曲时间对成曲品质的影响

制曲时间对曲料感官质量的影响见表6。

表6 制曲时间对曲料感官质量的影响Table 6 Effect of koji-making time on sensoryquality of finished koji

由表6和图5可知，在制曲34～46 h期间，成曲中的孢子数和中性蛋白酶活力、糖化酶活力均在上升。这是因为此时米曲霉处于菌丝繁殖期，米曲霉生长分为4个周期，其酶系的分泌主要是在菌丝繁殖期，故随着制曲时间的增长，酶活升高，酶系越完全。而制曲40 h后米曲霉处于孢子着生期，菌丝开始生产孢子，故在制曲40 h后成曲中的蛋白酶活力上升缓慢。由图5可知，在制曲58 h时，成曲中糖化酶活力达到最大值1077.5 U/g，这可能是部分菌丝在30 h开始产生孢子，这些孢子在50 h时二次萌发，故制曲时间增长，孢子数也随之增多。在制曲46 h时后成曲中蛋白酶活力增长缓慢，糖化酶活力下降，从经济及防止碳水化合物损失的角度来看，随着制曲时间的增长，曲料中的营养物质损失越多，因此制曲时间以46 h为宜。

2.6 翻曲次数对成曲品质的影响

翻曲次数对曲料感官质量的影响见表7。

表7 翻曲次数对曲料感官质量的影响Table 7 Effect of koji stirring times on sensory quality of finished koji

由表7和图6可知，成曲中孢子数随着翻曲次数的增加而下降，中性蛋白酶活力和糖化酶活力均在翻曲2次时达到最大值2005.1，747.2 U/g，水分含量在翻曲2次时达到最小值。这是因为在制曲过程中，米曲霉菌丝不断生长，曲料容易结块，从而导致品温升高，容易出现烧曲现象，影响曲霉的生长，菌丝减少，影响酶活[12]，此时应该进行翻曲，将曲料打碎翻动，使曲料疏松。翻曲次数过多，虽然可以使曲料疏松，氧气充足，但曲料沾染杂菌的几率也随之增大，会与米曲霉争夺生长空间，从而影响米曲霉的生长。因此，翻曲次数以2次为宜。

图6 翻曲次数对成曲中水分含量、孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响Fig.6 Effect of koji stirring times on moisture content,spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.7 接种量对成曲品质的影响

接种量对曲料感官质量的影响见表8。

表8 接种量对曲料感官质量的影响Table 8 Effect of inoculation amount on sensory quality of finished koji

由表8和图7可知，糖化酶随着接种量的增加而增加，在接种量为1.5%时达到最大值847.7 U/g。水分含量随着接种量的增加而降低。中性蛋白酶活力和孢子数随着接种量增加无显著性差异(p>0.05)。接种量在1%、1.5%、2%时，米曲霉长势很好，曲料表面都长满了嫩绿色的孢子，有浓厚的曲香味，接种量为0.5%时，米曲霉长势稍差。因此，接种量以1.5%为宜。

图7 接种量对成曲中水分含量、孢子数、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.8 优化制曲工艺条件的L9(33)正交试验结果

在单因素试验的基础上，选择原料配比、润水量、制曲时间三因素的三水平设计正交试验，测定成曲中的孢子数、中性蛋白酶活力、糖化酶活力，结果见表9。

表9 优化制曲工艺条件的L9(33)正交试验结果Table 9 L9(33) orthogonal test results for optimization of koji-making conditions

由表9可知，各因素对中性蛋白酶活力的影响大小依次为B>C>A，最优组合为A3B3C1;各因素对糖化酶活力的影响大小依次为A>B>C，最优组合为A3B1C1；各因素对中孢子数的影响大小依次为A>B>C，最优组合为A3B2C2。由正交表可知，当虾壳和面粉比例为10∶5，制曲时间为46 h时糖化酶活力最高、中性蛋白酶活力较高，当润水量80%时孢子数最高且糖化酶活力、中性蛋白酶活力较高。综上所述，最优方案为A3B2C1,即虾壳和面粉比例10∶5，润水量80%，制曲时间46 h为最优制曲工艺。

3 结论

采用单因素试验设计和L9(33)正交试验设计对虾壳酱油的制曲工艺进行了研究，确定最优的工艺条件为：虾壳粉碎至约蚕豆大小，虾壳面粉配比10∶5，润水量80%，蒸料时间20 min，制曲46 h，翻曲2次，接种量1.5%。按照最优工艺条件进行虾壳酱油的制曲，得到的成曲中蛋白酶活力达到了2160.8 U/g，糖化酶活力达到810.1 U/g，孢子数达到8.9×108CFU/g，成曲表面孢子浓密，均匀丛生，具有浓郁曲香，满足酱油中成曲的质量要求。