木犀草素治疗卵巢过度刺激综合征的实验研究*

张曦倩， 姚俐， 罗燕群， 朱秀兰， 许虹， 董梅， 刘风华

广东省妇幼保健院生殖中心(广东广州 511442)

卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中应用促排卵药物所导致的医源性疾病，主要表现为卵巢增大、胸腹腔积液、血液浓缩等，严重时出现电解质紊乱、凝血功能障碍、肾功能损害，不仅影响胚胎发育和妊娠率，甚至危及患者生命[1-2]。OHSS的发病机制复杂，其中卵巢组织炎症过度反应和毛细血管通透性增加在其中发挥重要作用[3]。目前临床对OHSS的治疗主要是对症支持治疗，尚无特效手段，因此，寻求新的治疗策略迫在眉睫。近年来有研究发现，中药方剂或制剂在OHSS中的治疗可能具有一定的前景，如补肾安胎方可减少卵巢颗粒细胞凋亡等[4]。然而，中药处方往往有效成分不明，给临床工作及研究带来很大困难，明确治疗OHSS的有效成分意义重大。木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，存在于多种中药及天然植物中，具有多种药理活性，如抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等作用[5]，此外，研究表明木犀草素在调控血管通透性方面亦作用显著[6- 7]。基于木犀草素的药理作用及OHSS的发病机制，我们猜测木犀草素可能对OHSS具有一定的治疗作用。2018年6月至2019年5月本研究以OHSS模型大鼠作为研究对象，通过观察卵巢组织中炎症因子白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、血管内皮生长因子(VEGF)及受体(VEGFR)-2的表达，并首次探讨木犀草素对OHSS模型大鼠炎症反应及血管通透性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SFP级健康未成熟雌性SD大鼠24只(广东省医学实验动物中心提供)，22日龄，(50.2±4.71)g，饲养于SPF动物饲养房，自然昼夜光线照明，室内通风好，相对湿度40%～70%，室温(22±2)℃，光暗周期为12 h，水食自取，喂饲普通饲料。

1.2 试剂与仪器 木犀草素(分子式：C15H10O6，分子：286.24，纯度98%)购自美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠购自美国Sigma公司；孕马血清促性腺激素(PMSG)购自上海恒斐生物科技有限公司；人绒毛膜促性腺激素(HCG)购自上海淳麦生物科技有限公司；大鼠VEGF、IL-6酶联免疫法(ELISA)试剂盒购自美国eBioscience公司；VEGFR-2一抗、Actin一抗及相应二抗购自美国CST公司；其他实验常用试剂购自广州永津生物有限公司；多功能酶标仪为美国Spectramax M5型；Western blot电泳仪、电转仪为Bio-Rad公司产品。

1.3 造模方法及给药方法 随机将大鼠分为正常对照组、模型对照组和木犀草素组，每组8只。其中模型对照组和木犀草素组按改良的Ujioka等[8]的方法建立OHSS模型：每只大鼠从22～25日龄连续皮下注射含10 IU PMSG 的0.1 mL 生理盐水，1次/d，末次注射PMSG 1 d后予皮下注射含100 IU HCG的 0.1 mL 生理盐水；造模过程中，正常对照组采用0.1 mL生理盐水皮下注射。木犀草素组采用0.5%羧甲基纤维素钠溶液将木犀草素配成的混悬液20 mg/(kg·d)灌胃，正常对照组和模型对照组分别给予等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，与造模同时开始，以上3组组均于22日龄开始灌胃，连续给药1周。

1.4 标本采集 于HCG注射48 h后(28日龄最后1次灌胃给药后)颈椎脱臼法处死大鼠，分离双侧卵巢并称重，称重后快速匀浆-20℃保存，用于ELISA 和Western blot实验。

1.5 ELISA检测各组大鼠卵巢组织中VEGF、IL-6的水平 各组大鼠卵巢匀浆组织中VEGF、IL-6的水平测定采用ELISA法，检测步骤参考相应试剂盒说明书。

1.6 Western blot法检测各组大鼠卵巢组织VEGFR-2蛋白的表达 各组大鼠卵巢组织匀浆后， BCA法行蛋白定量，每组各取30 μg蛋白液，行10%SDS-Page凝胶电泳，转膜，加入一抗VEGFR-2(1∶1 000)、Actin (1∶2 000)，4℃孵育过夜，加入相应二抗(1∶2 000)，室温孵育1h后行发光显影，Image J分析条带灰度值。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢重量比较 模型对照组大鼠卵巢重量明显高于正常对照组(t=17.93,P<0.01)；而木犀草素连续灌胃后，大鼠的卵巢重量明显减轻(t=5.505,P<0.01)。见图1。

注：*与模型对照组比较P<0.01

2.2 各组大鼠卵巢组织VEGF及IL-6水平的比较 模型对照组大鼠卵巢VEGF的水平明显高于正常对照组(t=18.90,P<0.01)，而木犀草素连续灌胃后，大鼠的卵巢VEGF的水平明显降低(t=15.27,P<0.01)，见图2-A。模型对照组大鼠卵巢IL-6的水平明显高于正常对照组(t=16.22,P<0.01)，而木犀草素连续灌胃后，大鼠的卵巢IL-6的水平明显降低(t=12.89,P<0.01)，见图2-B。

注：A:VEGF;B:IL-6; *与模型对照组比较P<0.01

2.3 各组大鼠卵巢组织VEGFR-2表达水平的比较 模型对照组大鼠卵巢VEGFR-2的水平明显高于正常对照组(t=13.63,P<0.01)，而木犀草素连续灌胃后，大鼠的卵巢VEGFR-2的表达水平明显降低(t=14.55,P<0.01)。见图3。

注：A：各组VEGFR-2蛋白表达；B：各组蛋白条带分析；*与模型对照组比较P<0.01

3 讨论

OHSS的经典生理变化为小动脉血管扩张和血管通透性增加，导致血管内液体外渗，引起第三间隙液体潴留，造成低血容量、低钠血症、血液浓缩、中心静脉压降低[3, 9-10]。OHSS的发病机制错综复杂，近年来的研究认为，VEGF、肾素-血管紧张素-醛固酮系统，以及全身或局部的炎性介质如IL-6、IL-11、PGE2及COX-2均可能直接或间接参与了OHSS的发生、发展过程[3, 11-13]。其中，VEGF被认为是引起OHSS患者卵巢血管通透性增加的最重要因素[3, 11]。HCG在OHSS的病理生理过程中发挥重要作用，其作用于卵巢颗粒细胞后可使VEGF mRNA及VEGFR-2表达增加，VEGF作用于卵巢组织血管内皮细胞的VEGF-2使其磷酸化，而后调控血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin)、紧密连接蛋白Nectin 2及Claudin 5等连接蛋白，并抑制此3种连接蛋白的表达，升高的VEGF抑制这3种连接蛋白的表达，进而使内皮细胞间的连接变得松散，血管通透性增加，加快OHSS的发生[11, 14- 15]。急性全身或局部炎症在OHSS发病过程中同样起着重要作用，研究人员发现，OHSS患者血清中早期炎症反应因子C反应蛋白的水平明显升高[16]。Geva 等[17]发现, OHSS 患者取卵日卵泡液中的IL-6 水平较正常对照组相比显著升高，并认为取卵日卵泡液中的IL-6 浓度可作为高危者OHSS 早期发展的预测因子。Atilgan等[18]在OHSS大鼠中同样发现炎症因子如IL-6、TNF-α等显著升高，而抑制炎症反应可显著改善OHSS病理发生、发展。本研究中，我们采用经典的造模手段建立OHSS大鼠模型，我们发现，与文献报道中的结果一致，模型对照组大鼠的卵巢重量较正常对照组明显增多；ELISA结果显示，模型对照大鼠卵巢组织中VEGF和炎症因子IL-6和水平显著升高，Western blot结果发现模型对照大鼠卵巢组织中VEGFR-2蛋白表达明显升高，表明本研究OHSS造模成功。

由于OHSS的发病机制尚未明确，治疗上以对症支持治疗为主，效果不尽人意，严重者不得不终止妊娠[19-20]。考虑到炎症反应和毛细血管通透性增高在OHSS发生发展中的地位，探寻具有抗炎和调控血管通透性的治疗策略，对于OHSS的治疗可能具有较好的前景。黄酮类化合物木犀草素在自然界中分布广泛，因其最初是从草本植物木犀草的枝叶中分离出而得名，近年来研究发现金银花、菊花、荆芥、黄芩属、紫苏属等天然药材中均含有木犀草素，其因具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理作用备受关注。既往国内外在体实验研究发现，木犀草素剂量高达每天100 mg/kg 也未有明显毒副作用的报道[21-22]，而本研究所用木犀草素浓度为每天20 mg/kg,远低于每天100 mg/kg，因此我们认为该浓度较为安全。有研究证实，木犀草素可以通过多个细胞信号通路发挥其药理作用，包括MAPK、Akt、NF-κB等，其可以有效改善LPS诱导的肿瘤坏死因子-α、IL-6生成[23-27]。本研究也发现，使用木犀草素连续给药后，OHSS大鼠卵巢组织中炎症因子IL-6的水平显著降低。此外，木犀草素在调控血管通透性方面亦作用显著。Cook等[6]发现，木犀草素可通过阻断VEGF生成调控血管通透性，进而抑制乳腺癌的肺转移。木犀草素还可以通过抑制炎症因子产生及抑制VEGF生成达到治疗过敏性/炎症性皮肤病的效果[28]。然而目前尚未有研究使用木犀草素对OHSS进行治疗探讨。本研究发现，连续使用木犀草素给药后，OHSS模型大鼠的卵巢重量显著减轻；ELISA结果显示，木犀草素可显著降低OHSS模型大鼠卵巢组织中VEGF和炎症因子IL-6和水平；Western blot结果也发现，木犀草素可有效降低OHSS模型大鼠卵巢组织中VEGFR-2蛋白的表达，表明木犀草素可能通过抑制炎症反应及调控血管通透性从而达到治疗OHSS的目的。

综上所述，木犀草素可有效减轻OHSS模型对照组大鼠的卵巢重量，以及抑制OHSS模型大鼠卵巢组织IL-6、VEGF的升高，并降低VEGFR-2的表达水平，对未来OHSS的临床治疗研究提供参考，且对中药或天然植物药治疗OHSS提供一定的理论依据。然而，本研究目前只从现象学层面观察了木犀草素治疗OHSS的作用，并未在分子水平和基因层面深入探讨其抗炎以及调控血管通透性的作用机制，我们将在今后开展进一步工作予以证实。