VEGF和p38MAPK在兔退变性腰椎间盘中的表达及意义

张志强，黄吉军，杨建东，陈 涛，陈 聪，范新宇

（江苏省苏北人民医院骨科，江苏 扬州 225000）

椎间盘退行性变（Intervertebral disc degeneration, IDD）是一种慢性、进行性的病理过程和机能紊乱，目前引起腰椎间盘退变的具体机制尚不明确。正常椎间盘组织没有血管，有研究提示[1-2]，椎间盘的血管化以及椎间盘细胞外基质成分改变是椎间盘退变的发病基础。因为微血管的侵入可激活或加强基质降解酶，细胞外基质合成和分解代谢的失衡，从而导致椎间盘退变。而在细胞外基质调节中，MAPK信号通道发挥着重要作用[3]。然而，在退变椎间盘中，新生血管与p38MAPK信号通道的关系，目前研究较少。本文旨在通过构建兔椎间盘退变模型，来探讨VEGF和p38MAPK在椎间盘退变中的作用。

1 资料与方法

1.1 兔腰椎间盘退变动物模型的建立

取健康4月龄雄性新西兰大白兔10只，质量2.5～3.0 kg，每只新西兰大白兔L2/3和L3/4椎间盘作为穿刺干预椎间盘，为模型组。L1/2和L5/6椎间盘作为空白对照组。C形臂下定位椎间隙平面，使用18 G穿刺针破皮，调整角度取与椎间隙平面一致、与上下横突平面呈30°角方向缓慢进针。透视下确认针头接近椎间盘纤维环，进行穿刺，穿刺有落空感后即停止，反复穿刺5次破坏纤维环。于术后8周处死动物，取椎间盘标本行病理学检查。

1.2 HE染色观察组织退变

挑选满意切片，HE染色后观察椎间盘组织中有无血管组织浸润，软骨细胞是否增生，纤维板状结构有无破坏，基质是否增生，以此确定是否有椎间盘的退变。

1.3 免疫组织化学染色和图像分析

用标准免疫组织化学方法，试剂购自福州迈新公司。分别检测VEGF，和p-p38MAPK。按照试剂说明进行实验，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。细胞质内出现棕黄色颗粒样物质为阳性。免疫组化染色中胞浆或胞膜中出现红色颗粒判断为阳性细胞。每例标本做三张切片，每张切片随机选取5个视野应用计算机彩色图像分析系统进行定量分析，计算平均光密度值（OD值）代表染色的强度。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0软件分析实验数据，实验数据用均数标准差（±s）描述，采用t检验，P值＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

整个实验期间，实验的新西兰大白兔均未出现明显饮食变化、瘫痪以及大小便失禁等异常情况。

2.1 HE染色检测结果

对照组：整个椎间盘组织结构清晰，胶原纤维走形有序，髓核与纤维环界限清楚。纤维环完整，髓核内细胞较小，呈圆形和类圆形，数量较多，软骨终板结构清晰，软骨细胞较多，增生活跃。实验组：椎间盘组织退变严重，纤维环胶原纤维排列紊乱，出现缝隙，断裂或缺失，髓核内胶原排列紊乱，基质明显降解。细胞变大变圆，且细胞群集，周围形成大量基质。

2.2 免疫组化及检测结果

VEGF在椎间盘组织中的表达变化：对照组：VEGF表达阳性表达主要集中在纤维环周围组织中的血管内皮细胞。而在组织中软骨终板、髓核内几乎看不到阳性细胞；实验组：椎间盘中大量出现的血管内皮细胞中呈强阳性表达。

p-p38MAPK在椎间盘组织中的表达变化：对照组中部分组织切片，细胞胞浆和细胞核内见浅棕黄色颗粒，呈弱阳性表达，部分细胞核不仅棕黄色颗粒，呈阴性表达。实验组中，绝大部分组织切片都可见髓核细胞核及靠近核膜的胞质内可见棕黄色或棕褐色颗粒，呈强阳性表达。

每例标本做三张切片,分别在高倍镜下测其光密度值，计算平均光密度值（OD值），进行半定量分析。实验组VEGF的OD值明显高于对照组，实验组p-p38MAPK的O D值明显高于对照组。结果见表1，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 VEGF、p-p38MAPK在对照组和实验组椎间盘中的表达（OD值）

3 讨 论

椎间盘组织的逐渐退变与衰老、过度负荷、遗传及肥胖等多种因素有关。椎间盘退变的实质是基质成分的降解。但引起其退变的具体机制还不是很明了。血管内皮生长因子 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)在血管生成过程中起着关键作用，能促进血管内皮细胞分裂，逐渐形成丰富的毛细血管网[4]。通过我们的实验发现，随着椎间盘退变的发生，VEGF明显高于对照组。说明椎间盘的退变伴随着血管的入侵。我们认为，由于血管的侵入可能满足了基质降解酶激活所需要的条件,进而导致基质的降解,继发椎间盘退变。

p38-MAPK广泛存在于哺乳动物细胞内，将细胞外刺激信号转导至细胞核和细胞质中，引起细胞生物学反应，主要参与细胞应激和炎症反应[3]。我们的研究表明，p38-MAPK的表达明显在实验组明显高于对照组。说明随着椎间盘退变的发生，伴随着p38-MAPK通路的激活。

在新生血管周围，淋巴细胞、巨噬细胞散在或围绕血管分布，向椎间盘内迁移的内皮细胞是新毛细血管形成的主体细胞[5,6]，椎间盘局部血管增生引发炎症反应，导致巨噬细胞、神经纤维细胞、内皮细胞等大量细胞及炎性生长因子的级联反应。而在这些因素的作用下，通过激活p38-MAPK通路调控细胞的增殖、分化及凋亡，影响着椎间盘的退变的发生和发展。

综上所述，在椎间盘组织中 VEGF和p-p38MAPK的表达和椎间盘组织结构的变化具有相似性，其表达强度与椎间盘的退变密切相关。VEGF和p-p38MAPK可能在缓解或抑制腰椎间盘退变中起到一定作用。