芍药根不同部位特征图谱研究*

史素影，俞年军△，彭代银，张雨雷，朱 强，葛德助，马 磊，Sven Schroder，韩荣春

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.亳州市皖北药业有限公司，安徽 亳州 236800；3.安徽普仁中药饮片有限公司，安徽 亳州 236800；4.安徽济人药业有限公司，安徽 亳州 236800；5.汉堡大学附属埃彭多夫医院汉萨美安中医中心，汉堡 埃彭多夫 20095）

毛莨科植物芍药P.lactiflora Pall.的根，水煮去皮或去皮水煮后干燥作白芍药用，味苦、酸、微寒，归肝、脾经，具有养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[1]。亳州芍药栽培历史悠久，栽种品种是芍药，花红单叶，种植面积大，亳白芍为白芍道地药材来源之一，在安徽省亳州市的各乡镇皆有种植。亳白芍色白粉足、产量亦大，于每年的九、十月份采挖，采收后的药材经产地初加工后销往各地。白芍的加工需要去皮，关于去皮的处理，自古便有详细记载，如张仲景的《金匮玉函经》中有“刮去皮”[2]、《雷公炮制论》中有“以竹刀刮去粗皮并头土”[3]、《本草图经》中有“采得刮净去皮”[3]等。相关研究表明，芍药根所含的化学成分主要包括单萜及其苷类化合物、三萜类化合物、黄酮类化合物、鞣质（主要是以没食子酸为基础）、酚酸和多糖等[4-8]。诸多文献报道的具有相对明确药理活性的成分有芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰葡萄糖等[9-13]。一般芍药根去皮处理除去的“皮”包括全部的栓皮部和少量的韧皮部，余下晒干的药材由部分的韧皮部和全部的木质部组成，“去皮”势必会对化学成分产生影响，进而影响药材的药理作用。本文则把新鲜的亳白芍根的栓皮、韧皮和木质部剥离，并建立HPLC特征图谱，探讨不同部位中化学成分的差异，为后期研究白芍赤芍不同功效主治的成因奠定基础。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国，G1311X四元梯度泵，G1329自动进样器，G1316A柱温箱，G1315G二级管阵列检测器）；CP225D型1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q Gradient A10超纯水仪（密理博上海贸易有限公司）；AS30600BT系列超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

芍药苷（批号X12ABC33672，纯度≥98%）、氧化芍药苷（批号P12N9S74762，纯度≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司；芍药内酯苷（批号DST190120-071，纯度≥98%）、苯甲酰芍药苷（批号DST190719-053，纯度≥98%）、没食子酸（批号 DST190715-08，纯度≥98%）、苯甲酸（批号DST190609-001，纯度≥98%）、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖（批 号DST190517-001，纯度≥98%）购于乐美天医药公司；乙腈（瑞典oceanpak，色谱纯）；超纯水、蒸馏水（自制）；磷酸（天津永大化学试剂有限公司，色谱纯）；乙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯）。

1.2 药材 本实验所用芍药根由课题组采挖于于安徽省亳州市，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定皆为毛莨科植物芍药P.lactiflora Pall.的根。样品信息见表1。

表1 白芍样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Topsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱 0～40 min，5%～50%A；40～41 min，50%～5%A；41～45 min，5%A；柱温 30 ℃；流速 1.0 mL·min-1，检测波长230 nm，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取芍药苷、氧化芍药苷、芍药内脂苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、苯甲酸、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖对照品适量，用甲醇配成含芍药苷 1.1 mg·mL-1、氧化芍药苷 0.6 mg·mL-1、芍药内脂苷 1.0 mg·mL-1、苯甲酰芍药苷 0.6 mg·mL-1、没食子酸 2.2 mg·mL-1、苯甲酸0.1 mg·mL-1、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖 1.8 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取药材粉末（过4号筛）约 10 mg，精密称定，置 2 mL EP（eppendorf）管中，加50%乙醇1 mL，超声处理30 min，取出，摇匀，滤过，取续滤液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取同一混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，以芍药苷峰（峰4）为参比峰，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性实验 取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24 h 按照 2.1 项下色谱条件进样，记录色谱图，以芍药苷峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于2.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性实验 取同一批样品，按照2.2.2项下方法平行制备6份溶液，按照2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，以芍药苷峰为参比峰，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的 RSD均小于2.7%，表明该方法重复性良好。

2.4 特征图谱建立 将18批样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，导出色谱图。将栓皮部、韧皮部、木质部样品色谱图分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版），进行共有峰处理。S1、S7、S13自动校正匹配，生成对照特征图谱，分别得到3组样品的特征图谱，对照品图谱、样品叠加图及特征图谱见图1。

图1 混合对照品、样品图谱及特征图谱

2.4.1 共有峰确认 根据3组样品的特征图谱分析结果，栓皮部有15个共有峰，韧皮部有13个共有峰，木质部有7个共有峰。经过与对照品比对，指认了7个特征峰，2号峰为没食子酸，4号峰为氧化芍药苷，6号峰为芍药内酯苷，7号峰为芍药苷，8号峰为1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，10 号峰为苯甲酸，12号峰为苯甲酰芍药苷，其余峰对应的化合物未知。

2.4.2 相似度分析 将18批样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）软件，对各图谱进行相似度计算，结果见表2。相似度结果分析表明，栓皮部组内（S1～S6）相似度均不小于0.900、韧皮部组内（S7～S12）相似度均不小于0.920、木质部组内（S13～S18）相似度均不小于0.994，说明同一部位的化学成分类似；栓皮部与韧皮部的相似度位于0.841～0.974之间、栓皮部与木质部的相似度介于0.586～0.766之间、韧皮部与木质部的相似度在0.653～0.928之间，表明不同部位的化学成分有差异，栓皮部与木质部的差异最大。

表2 样品图谱的相似度

2.4.3 聚类分析 将18批样品按栓皮部的15个峰的峰面积数据导入SPSS 23.0软件进行聚类分析（韧皮、木质部无峰的峰面积记为0），以平方欧式距离为测量区间，采用质心聚类的方法对数据进行分析[14]，见图 2。18 批样品被分成 3 类，S1、S6（栓皮部）未与S2、S3、S4、S5聚为一类；S13 ～ S18（木质部）聚为一类，S2 ～S5（栓皮部）聚为一类，S7～S12（韧皮部）聚为一类。因此，除S1、S6外，聚类分析将栓皮、韧皮和木质部分别聚为一类，其中栓皮和韧皮中化学成分较木质部相近。因实验样品的选取未控制药材的栽培年限、生长环境等的一致，各组内图谱存在差异，导致S1、S6不与栓皮组其余4个样品聚为一类且栓皮组PCA得分差异大，可见生长年限和环境条件对芍药根化学成分的影响，由外向内逐渐减弱。

图2 聚类树状图

2.4.4 主成分分析 将18批样品的15个峰的峰面积数据导入 SPSS 23.0软件进行主成分分析，得出各共有峰方差贡献表，见表3，15个峰中得出3种主成分，第1主成分贡献率为70.82%，第2主成分贡献率为12.26%，第3主成分贡献率为8.42%，3种主成分累积贡献率达91.50%。将样品的15个峰峰面积导入 SIMCA-P（11.0）中，进行主成分分析[15]，得到峰得分图和样品PCA得分图，见图3、图4。由峰得分图可知，6、10和7号峰为3个主成分峰，3个主要成分分别为芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酸。从样品PCA得分图可看出S13～S18即木质部彼此靠近，S7～S12即韧皮部彼此靠近但较木质部松散，S1～S6代表的栓皮部则最分散、彼此疏离，此结果与聚类分析一致。

图3 峰得分图

图4 样品PCA得分图

表3 总方差解释

2.4.5 主要成分含量测定 取2.2.1项下的对照品溶液用甲醇分别稀释至 1/2、1/5、1/10、1/20、1/40 倍，得到6个不同浓度的混合对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行检测，平行测定3次，求平均值，以对照品浓度（X）与峰面积（Y）计算标准曲线。由主成分分析可知，芍药苷、芍药内脂苷和苯甲酸为主要成分，3个主要成分的线性关系见表4，含量测定结果见表5。

表4 3个主要成分的线性关系

将主要成分的含量测定结果进行方差分析，3个主要成分的含量在栓皮部、韧皮部和木质部间两两比较，比较结果见图5。由图5可知：芍药内酯苷在栓皮部和韧皮部的含量没有显著性差异；芍药苷在栓皮部、韧皮部和木质部的含量均不存在显著性差异；苯甲酸在栓皮部中的含量高于韧皮部，木质部中含量极低。

表5 含量测定结果（n=3）

图5 不同部位主要成分的含量比较（**P<0.01）

3 讨论

本实验通过HPLC法得到了芍药根栓皮部、韧皮部和木质部的容易识别、分离度较好的特征图谱，3个部分的特征图谱显示：栓皮部分离出 15个共有峰，韧皮部分离出 13个共有峰，木质部分离出 7个共有峰。芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酸3个主要共有成分在各部分的分布情况并不像预期的那样，在3个部位含量的从外向内依次显著递减。但结合特征图谱的共有峰数和样品PCA图来看，栓皮部提取液能分离出更多的成分且浓度稍高，木质部提取液分离出的成分少且浓度较低，韧皮部则介于两者之间。

本实验研究的对象是亳州栽培芍药的新鲜根，采挖后立即洗净泥土，分取栓皮、韧皮和木质部，药材稍干后分取较困难。对于提取溶剂的选择，文献资料报道的主要有有乙醇-水、甲醇-水的不同比例，在这些研究的基础上，笔者发现这些不同比例溶剂对成分的提取效率稍有差异，但对芍药中常见成分提取的影响并不显著，因此选用50%乙醇提取；流动相与检测波长的选择，基于已有的文献报道，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长选择为230 nm；数据结果分析处理的方法亦参考了相似的文献报道[16-20]。中药白芍的加工中需去皮，一般去皮处理，除去的不仅有栓皮，还有少部分的韧皮。由含量测定结果可知，去皮与否对芍药苷含量影响不大，对芍药内酯苷和苯甲酸的含量影响较大，这或许是导致白芍、赤芍功效不同的原因之一。