离子液体预处理对奇岗草木素脱除率及酶解效率的影响

周全伟 王 超，* 杨桂花 许 凤，2 张 凯 陈嘉川，*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室/制浆造纸科学与技术教育部重点实验室，山东济南，250353；2.北京林业大学林木生物质化学北京市重点实验室，北京，100083）

为了缓解能源危机，储量丰富且来源广泛的农林生物质可以用来生产燃料乙醇，因而在能源领域备受关注。农林生物质细胞壁的主要组分为纤维素、半纤维素和木素，其中木素复杂的化学结构致使生物质细胞壁结构具有顽抗性[1]。为了促进农林生物质的高效转化，需要降低木素结构的顽抗性，增加纤维素水解的可及性[2-3]。因此，高效脱木素对农林生物质高值化利用具有重要现实意义。当前基于脱除木素的预处理方法有物理法（机械粉碎、热解、蒸汽预处理等）、化学法（酸预处理、碱预处理等）、生物法（微生物和酶）等[4-5]，其中化学法[6]使用乙醇等化学溶剂脱除木素。通过预处理脱除木素进一步促进了生物质的利用，缓解了能源危机，但其存在处理效率低、腐蚀设备、对环境产生污染等缺点。

离子液体是一种新型绿色溶剂，具有良好的热稳定性和环境兼容性。2002 年，Swatloski 等人[7]首次发现咪唑类离子液体可以溶解纤维素。之后，离子液体处理生物质得到了广泛研究[8-10]。相比于其他预处理方式，离子液体预处理方式有其独特的优势。Li 等人[11]使用稀酸和离子液体[C2mim][OAc]分别处理柳枝稷，发现离子液体处理效率更高，且原料降解损失较少。Sathitsuksanoh 等人[12]使用离子液体[C2mim][OAc]预处理芒草、麦草和松木3种原料并酶水解制备可再生化学品，重点研究了木素在经过离子液体、酶水解等处理后的结构变化。但咪唑类离子液体存在成本高、毒性大、回收困难等问题，因而限制了离子液体的生物质工业化进程[13]。新型醇胺类离子液体因其具备良好的生物兼容性、成本低且制备过程简单等优点近年来受到研究者的关注。Sun 等人[14]合成了醇胺醋酸盐并用来预处理柳枝稷糖化发酵制生物乙醇。但这些报道并没有探究离子液体处理对生物质原料物理化学性质的影响。

奇岗草具有种植简单、再生能力强、产量高、纤维品质好、灰分含量低等优点，是一种有潜力的能源植物[15]。与农业废弃物相比，对奇岗草的离子液体处理研究较少。因此本研究利用低成本的离子液体乙醇胺醋酸盐[EOA][OAc]对奇岗草进行预处理，优化确定脱木素预处理工艺条件，以提高奇岗草的酶水解效率。通过扫描电子显微镜、X 射线衍射和红外光谱等表征方法，探索奇岗草经预处理后的物理化学特性变化，旨在为农林生物质的高值化利用提供理论指导。

1 实 验

1.1 实验原料

奇岗草，取自北京林业大学实验林区。首先，将风干后的奇岗草原料粉碎，取40～60目奇岗草进行甲苯/乙醇（2∶1，体积比）抽提6 h，风干过夜，然后置于105℃烘箱中干燥24 h，储存备用。甲苯、乙醇、乙酸、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等试剂购自国药集团；离子液体1-丁基-3-甲基-咪唑醋酸盐（[BMIM][OAc]）、1-丁基-3-甲基-咪唑氯盐（[BMIM][Cl]）购自林州市科能材料科技有限公司；Cellucast 1.5 L（混合酶）购自青岛中新国际贸易有限公司。

根据文献报道[16]，按照乙酸与醇胺（乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺）1.1∶1的摩尔比，将乙酸逐滴加入到醇胺溶液中，在50℃下搅拌反应48 h（500 r/min），旋转蒸发除去过量乙酸，60℃下真空干燥48 h，得到离子液体乙醇胺醋酸盐（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸盐（[DEOA][OAc]）、三乙醇胺醋酸盐（[TEOA][OAc]）。表1为本实验所用离子液体的化学结构。

表1 离子液体的阳离子、阴离子化学结构

1.2 离子液体预处理

将奇岗草和离子液体加入75 mL 耐压瓶中，放置反应器中并加热至设定温度，开始计时，磁力搅拌，转速为500 r/min。反应结束后，冷却15 min，加入200 mL乙醇/水（1∶1，体积比）混合溶液终止反应。将混合体系在高转速（1200 r/min）条件下搅拌过夜。减压抽滤，用乙醇/水溶液多次洗涤，将回收的奇岗草干燥备用。

1.3 奇岗草分析表征

1.3.1 组分分析

奇岗草预处理前后样品的组分分析参考NREL[17]流程进行测定。采用两步酸解法测定聚葡萄糖、聚木糖和木素含量；木素脱除率和固体残渣率分别按式(1)和式(2)计算。

1.3.2 红外光谱（FT-IR）分析

对样品进行FT-IR（Bruker,VERTEX70,德国）分析。测定试样经溴化钾压片法得到，干燥后的样品与溴化钾的质量比为1∶100。每个样品在600～4500 cm-1波数范围内检测，扫描次数为32次。

1.3.3 X射线衍射（XRD）分析

采用X 射线衍射仪（Bruker AXS D8，德国）对离子液体预处理前后的奇岗草样品的纤维素晶型及结晶度进行测定。将干燥后的样品平铺在载玻片上，将载玻片放置于XRD 样品架上进行数据采集，扫描范围2θ为5°～80°。纤维素结晶度指数按照式(3)计算。

式中，CrI 为结晶度，%；I(002)为2θ=22°处的（002）晶面衍射强度；I(am)为2θ=18°处的无定形区衍射强度。

1.3.4 扫描电子显微镜（SEM）分析

将离子液体预处理前后的奇岗草样品干燥后进行喷金处理，置于SEM（COXEM，30 PLUS，韩国）下扫描分析。

1.4 酶水解实验

离子液体预处理前后的奇岗草样品酶水解实验步骤如下：称取0.3 g 酶解底物放入50 mL 酶解瓶中，加入15 mL pH 值为4.8的柠檬酸/柠檬酸钠缓存溶液，加入纤维素酶，酶用量为20 FPU/g底物，密封后放置于温度为50℃的恒温摇床中酶水解72 h,设定转速为150 r/min，定时取样，灭活后放置冰箱中冷冻待测。

1.5 产物分析

利用高效液相色谱仪（Waters，e2695，美国）对酶水解后葡萄糖、木糖进行测定。所用分析柱为Bio-Rad Amines HPX-87H 色谱柱，柱温箱为50℃，检测器为示差折光检测器，检测器温度为35℃，流动相为5 mmol/L硫酸水溶液，流速为0.6 mL/min。采用外标法定量。

葡萄糖和木糖的产率计算公式如式(4)和式(5)所示。

1.6 离子液体成本分析

乙醇胺和乙酸为大宗化学品试剂，根据阿里巴巴网上价格分别约为2000 美元/t 和600 美元/t。采用Chen 等人[18]报道的方程估算离子液体成本，如式(6)所示。

式中，P 为离子液体价格；M1和M2分别为乙醇胺和乙酸的相对分子质量；P1和P2分别为乙醇胺和乙酸的价格；经计算离子液体[EOA][OAc]的价格为1300美元/t。

1.7 离子液体[EOA][OAc]热稳定性分析

离子液体[EOA][OAc]热稳定性由同步热分析仪（NETZSCH，STA449 F3，德国）测量，测量范围30～600℃，使用N2作为载气，升温速率10℃/min。

图1 为离子液体[EOA][OAc]的热稳定检测图。由图1 可知，在温度140℃下，离子液体[EOA][OAc]质量损失8.46%，温度达到160℃时，离子液体[EOA][OAc]质量损失19.46%，因此预处理温度在140℃较为合适。

图1 离子液体[EOA][OAc]热稳定检测图

2 结果与讨论

2.1 不同类型离子液体预处理奇岗草的组分分析

为脱除奇岗草中的木素组分，合成了3 种醇胺类离子液体乙醇胺醋酸盐（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸盐（[DEOA][OAc]）和三乙醇胺醋酸盐（[TEOA][OAc]），并与1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐（[BMIM][OAc]）和1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[BMIM][Cl]）共5种离子液体分别处理奇岗草。取奇岗草原料1.5 g，按固液比1∶10 加入离子液体，探讨了不同离子液体预处理奇岗草的组分分析，实验结果见表2。

表2 不同离子液体预处理奇岗草的组分分析* %

如表2 所示，经不同离子液体预处理后，奇岗草的固体残渣率不同，说明不同离子液体对奇岗草组分溶解度不同。未经预处理奇岗草中，聚葡萄糖和聚木糖含量分别为37.99%和17.41%，Klason木素含量为16.79%。经不同离子液体预处理后，奇岗草固体残渣中聚葡萄糖和聚木糖相对含量发生了不同变化，木素含量降低，聚葡萄糖含量升高，聚木糖含量有高有低，可见不同离子液体对不同组分具有选择溶解性[19]。由表2 中数据可知，离子液体[EOA][OAc]处理奇岗草木素脱除率达到76.67%，预处理后聚葡萄糖含量和聚木糖含量分别由为未处理前的37.99%和17.41%升到52.49%和20.73%，Klason 木素含量由16.79%下降到7.69%。纤维素与半纤维素相对含量的增加主要源于木素的大量脱除，这说明离子液体[EOA][OAc]更倾向于溶解木素[14]。因此，[EOA][OAc]为较优预处理离子液体。

2.2 [EOA][OAC]预处理过程因素对奇岗草组分含量的影响

2.2.1 反应温度和反应时间

取绝干奇岗草粉1.5 g，按照固液比1∶10 加入离子液体[EOA][OAc]，改变反应温度和反应时间，探讨了不同反应温度（120、140、160℃）下不同反应时间对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响，结果见图2。

图2 反应温度和反应时间对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响

由图2(a)所示，在相同反应时间下，反应温度由120℃增至160℃时，固体残渣率逐渐降低；相同反应温度下，随着反应时间的增加，固体残渣率逐渐降低，原因可能是反应条件剧烈时，有更多的聚葡萄糖、聚木糖、木素溶解在离子液体中，进而导致固体残渣率降低，这些变化可由图2(c)、图2(d)中得到证实。由图2(c)、图2(d)可知，聚木糖脱除率（损失率）高于聚葡萄糖脱除率（损失率），原因可能是离子液体[EOA][OAc]会选择性溶解木素，与木素连接的碳水化合物（主要是聚木糖）也会随之脱除。

由图2(b)可知，当反应时间不变，反应温度增加时，木素脱除率升高；当反应温度不变，反应时间增加时，木素脱除率明显增加；原因可能是随着温度升高，离子液体黏度降低，促进了离子液体与原料的反应，促使更多木素溶出，但当反应时间足够时，离子液体溶解木素溶液趋向于饱和，木素脱除率趋于平缓。Yu 等人[20]使用氨和过氧化氢在150℃下预处理奇岗草，木素脱除率为71.6%。而使用离子液体[EOA][OAc]在140℃下预处理奇岗草5 h 后，木素脱除率达到76.67%。基于木素脱除率的评价，本实验较优预处理条件为140℃和5 h。

2.2.2 离子液体中水分含量

取绝干奇岗草粉1.5 g，按照固液比1∶10 加入离子液体[EOA][OAc]（140℃，5 h）。改变离子液体中的水分含量，探讨水分含量对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响，结果见图3。

由图3 可知，当离子液体水分含量由0 增加至15%时，固体残渣率逐渐升高，木素脱除率由76.67%下降至65.36%，原因可能是水分增加可以导致[EOA][OAc]与木素结合能力降低，因此固体残渣率升高，木素脱除率降低。据文献[21]报道，离子液体中少量的水分含量对木素的溶解影响不大，但过量的水会破坏离子液体的氢键结构，使得离子液体的周围被水包围，进而影响木素与离子液体之间的相互作用，导致木素溶解度下降。

当离子液体水分含量逐渐增加，聚葡萄糖的脱除率逐渐降低，水分含量由0增加至15%时，聚葡萄糖脱除率由11.98%下降到6.84%，原因是水分含量的增多降低了离子液体与纤维素氢键结合能力；当离子液体水分含量从0 增加到2%时，聚木糖脱除率有少量升高，原因是少量的水分与离子液体阴离子形成氢键，游离阳离子浓度增加，增大了对聚木糖的溶解能力，而水分含量超过一定量（2%），就会减弱离子液体中阳离子对聚木糖的溶解能力，导致聚木糖脱除率逐渐降低。吕本莲[22]研究了离子液体中水分含量对聚木糖的溶解度变化，也得到了相同结论。以木素脱除率的角度看，较适合的离子液体水分含量仍为0。

2.2.3 固液比

取绝干奇岗草粉1.5 g，加入不同固液比离子液体[EOA][OAc]（140℃，5 h），探讨不同固液比对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响，结果见图4。从图4可以看出，随着固液比的减小，固体残渣率逐渐降低后趋于稳定，聚葡萄糖、聚木糖脱除率逐渐增加，固液比从1∶5减小到1∶25，聚葡萄糖和聚木糖的脱除率分别从7.33%和21.77%提高到15.28%和28.03%。

固液比从1∶5 减小到1∶25，木素脱除率先从75.88%上升后逐渐稳定在80.84%，原因是固液比越小，单位质量的原料与更多体积的离子液体接触，增大了离子液体对原料的可及性，而固液比继续变小，离子液体对原料的反应效果趋于稳定，故脱木素效果趋于稳定。当固液比为1∶10 时，木素脱除率达到76.67%，固体残渣率已趋于稳定（63.14%），因此，较适宜的固液比为1∶10。

图3 离子液体中水分含量对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响

图4 固液比对奇岗草固体残渣率和组分脱除率的影响

图5 预处理前后奇岗草的XRD图

2.3 奇岗草的结晶度分析

因为纤维素材料具有结晶区和无定型区[23]，所以测定结晶度是了解纤维素材料的重要途径。图5所示为离子液体[EOA][OAc]预处理前后奇岗草的XRD图。

从图5 可以看出，奇岗草预处理前后在衍射图上显示出峰值在15°≤2θ≤20°和20°≤2θ≤25°，前者是纤维素无定形区引起的吸收峰，后者是纤维素结晶区引起的吸收峰。奇岗草结晶度指数（CrI）计算结果为：预处理前CrI 为49.10%，预处理后的CrI 为44.94%，CrI降低了4.16个百分点，有利于酶水解反应。

2.4 奇岗草的红外光谱分析

为了解离子液体预处理后固体残渣的组分变化，将经过离子液体[EOA][OAc]预处理前后的奇岗草进行FT-IR分析，结果见图6。

图6 预处理前后奇岗草的FT-IR图

由图6 所示，两条曲线出现的吸收峰基本一致，吸收峰强度略有不同。3429 cm-1处为羟基吸收峰。1729 cm-1附近的吸收峰归属于乙酰基中的C＝O 吸收振动，1041 cm-1处属于半纤维素吸收峰，在木质纤维原料中主要来源于聚木糖吸收，两条曲线中半纤维素的吸收峰都存在，且预处理后强度略高，说明预处理后半纤维素含量有所提高。1631、1515、1422 cm-1处是芳香族骨架吸收振动，即来源于木素。离子液体预处理后的FT-IR 图仍然有木素的特征吸收峰，说明预处理后奇岗草中仍然有木素。898 cm-1是碳水化合物中β-1,4 糖苷键连接的吸收[23]，本实验奇岗草经离子液体[EOA][OAc]预处理后898 cm-1处吸收峰值更高，说明预处理后聚葡萄糖含量提高。

2.5 奇岗草的表面形貌分析

图7 为离子液体[EOA][OAc]预处理前后奇岗草的表面形貌变化。由图7可知，预处理前的奇岗草结构紧密，纤维表面较为平整，与酶接触位点有限。经离子液体[EOA][OAc]预处理后，奇岗草纤维表面出现凹凸不平，利于酶水解。离子液体预处理后酶水解效率大大提高（见图8），原因可能是木素的大量去除增加了纤维的可及性，促进了酶水解效率。

图7 预处理前后奇岗草的表面形貌变化

2.6 奇岗草的酶解

利用离子液体[EOA][OAc]预处理脱出木素的目的是降低奇岗草原料结构的顽抗性，增加纤维素酶对纤维素的可及度，从而提高酶解效率。因此，选取2个有代表性的预处理后样品与未预处理奇岗草原料进行酶水解测试，来评估离子液体[EOA][OAc]预处理奇岗草的效果。具体的酶解产率见图8。

由图8(a)可知，随着酶水解时间的增加，葡萄糖产率逐渐增加，原因可能是木素的大量去除，增大了纤维素的可及度。由图8(b)可知，酶水解时间越长，木糖产率越高。Yu 等人[20]使用氨和过氧化氢预处理奇岗草，酶水解96 h 时，分别将90.2%纤维素、73.4%半纤维素转化为葡萄糖和木糖。而使用离子液体[EOA][OAc]预处理奇岗草，酶水解72 h时，未经预处理的奇岗草葡萄糖和木糖产率分别为15.97%和6.15%，经140℃下5 h离子液体预处理后奇岗草的葡萄糖和木糖产率分别为85.78%和79.78%，预处理后葡萄糖和木糖产率分别是预处理前的5.37和12.97倍，显著提高了奇岗草的酶解效率。

2.7 离子液体的循环使用

为了进一步降低离子液体使用成本，对离子液体[EOA][OAc]做了循环使用实验，实验结果见表3。

由表3 可知，随着[EOA][OAc]使用次数的增加，奇岗草固体残渣率逐渐升高，原因是离子液体[EOA][OAc]使用次数增加后其溶解木素的能力有所降低；同样奇岗草木素脱除率也随着使用次数的增加而降低，当离子液体[EOA][OAc]使用第3 次时，木素脱除率为(62.67±1.99)%，可见[EOA][OAc]重复使用3 次后仍有较好的脱木素性能，当离子液体[EOA][OAc]使用第5 次时，木素脱除率为(48.46±2.01)%，这说明[EOA][OAc]具有良好循环使用性能。且[EOA][OAc]的价格为1300 美元/t，其价格与大宗化学品价格接近，经济可行性较好。

图8 预处理前后奇岗草葡萄糖和木糖的酶解产率

表3 离子液体循环使用后固体残渣的组分分析

3 结 论

本研究以奇岗草为原料，探讨了不同工艺条件下离子液体对奇岗草木素的脱除率，并利用红外光谱、X 射线衍射和扫描电子显微镜分析了醇胺类离子液体预处理后奇岗草的官能团、结晶度和微观形貌的变化。

3.1 利用乙醇胺醋酸盐（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸盐（[DEOA][OAc]）、三乙醇胺醋酸盐（[TEOA][OAc]）、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐（[BMIM][OAc]）和1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[BMIM][Cl]）共5 种离子液体对奇岗草进行预处理，基于木素脱除效果比较，离子液体乙醇胺醋酸盐（[EOA][OAc]）的预处理效果最佳，其对奇岗草木素的脱除率最高。

3.2 离子液体[EOA][OAc]预处理较优条件为：反应温度140℃、反应时间5 h 和固液比1∶10，此条件下的木素脱除率为76.67%。

3.3 经离子液体[EOA][OAc]预处理的奇岗草进行酶水解72 h 后，葡萄糖和木糖产率分别为85.78%和79.78%，是未经预处理奇岗草酶水解后葡萄糖和木糖产率的5.37倍和12.97倍，预处理显著提高了奇岗草的酶解效率。

3.4 经[EOA][OAc]预处理后奇岗草的表面结构疏松，纤维素含量增加，晶型不变，结晶度降低。

3.5 离子液体[EOA][OAc]循环使用性能良好，当离子液体[EOA][OAc]循环使用第5 次后，其木素脱除率为(48.46±2.01)%。