澳门地区鸡源性产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌基因型检测

李婉芬, 王 璐, 谢咏琳, 方 琳, 毛文慧, 林倩琦, 林健邦, 王宝珍

大肠埃希菌是一种在肠道分布广泛的细菌亦是条件致病菌，大部分类型对人体无害，但有些型可致病，若人体内的大肠埃希菌含有耐药基因，可在肠道内转移到人类已适应的细菌或病原体中，这会延长疾病的时间和增加相关治疗的失败率。近年来，食用动物特别是肉鸡和水源的细菌中分离出大肠埃希菌菌株数量有上升趋势[1]。故本研究对澳门地区市售鸡源性产品中产ESBLs大肠埃希菌的分离、鉴定及耐药基因型进行分析，为澳门地区鸡源性产ESBLs大肠埃希菌的分布及其基因型分析提供可靠数据。

1 材料与方法

1.1试剂 琼脂糖(MERCK)，Luria-Bertani培养液(DIFCO)，麦康氏培养基(青岛高科园海博生物技术公司)，胰胨大豆琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术公司)，Müller-Hinton琼脂(BD)，胰胨大豆琼脂培养液(BD)，EC-MUG培养液(BD)，瓷珠菌种保存管(南京欧克生物技术公司)，质粒提取试剂盒(QIAprep)，头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)，头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)，克拉维酸(Clavulanic Acid, CA)，多聚酶链反应混合液(碧云天生物技术公司)，PCR引物(生工生物工程公司)，TE缓冲液(生工生物工程)，UView Dye和无菌水(BIO-RAD)，DNA分子尺(上海捷瑞生物工程公司)，PstI酶(BBI)，PvuII酶(BBI)。

1.2仪器 Vitek2(Biomerieux),GeneAmp核酸扩增仪和NanoDrop分光亮度计(Thermo)，多重荧光冷光影像系统，电泳仪和电泳供电器(BIO-RAD)，水浴箱(Julabo)，超纯水仪(Merck)，高温高压灭菌炉(HIRAYAMA)，台式离心机(Labnet)。

1.3样本来源 自2017年10月至2018年4月，以方便抽样方式购买澳门地区巿售的不同批次、品种、农场及加工厂，并在保质期当中的69个鸡源性产品。根据GB2707-2016《鲜(冻)畜、禽产品》[2]来定义样本，且按照GB/T9695. 19-2008《肉与肉制品取样方法》[3]和GB4789.1-2016《食品微生物学检验总则》[4]进行样本的收集、贮存和运送。

1.4 菌株来源

1.4.1标准菌株 本次研究中使用到的标准菌株有大肠埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)。

1.4.2样本菌株 参照GB16869-2005《鲜、冻禽产品》[5]的样本抽取和检验流程，以无菌方式称取25 g样本，加入225 mL缓冲蛋白胨水，振荡30 s后，从中吸取30 mL液体至无菌管中，并于44.5 ℃培养18～22 h。参照GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》[6]中大肠埃希菌的鉴定方法，及美国临床和实验室标准协会CLSI M100 (2017)[7]的标准，取10 μL增菌后的缓冲蛋白胨水涂抹在含1 mg/L CTX的麦康氏培养基上，44.5 ℃培养18～22 h。挑取可疑菌落3～5株，接种在胰胨大豆琼脂培养基上做纯培养。把细菌接种到EC-MUG培养液，于44.5 ℃培养18～22 h后，在366 nm紫外灯下产生蓝白色荧光，且产气的为阳性菌株，进行Vitek2的生化鉴定。

1.5 菌株药敏试验及基因分型

1.5.1药敏试验及ESBL筛选与确认试验 参考美国临床和实验室标准协会CLSI推荐的纸片扩散法(K-B法)[7]进行; ESBL初筛试验，将待测菌液用均匀涂布于M-H 平板，贴上抗生素纸片头孢他啶(CAZ 30 μg)和头孢噻肟(CTX 30 μg)，经37 ℃培养18～24 h，测定抑菌圈的直径，判断依据美国临床实验室标准值。

确定试验是采用CLSI的酶抑制剂增强双纸片扩散法[7]。先将待测菌株配成0.5 麦氏浊度菌液，均匀涂布于M-H 平板， 取头孢他啶(CAZ 30 μg)、头孢噻肟(CTX 30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(CAC，30/10 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(CTC，30/10 μg)，35 ℃培养18～24 h；若单药纸片(CAZ、CTX)与相应的纸片(CAC、CTC )中任何一对的抑菌环直径之差≥5 mm， 即确认该菌株为ESBL 耐药株。

1.5.2菌株保存 用瓷珠菌种保存管将菌株存储于-20 ℃的环境中。

1.5.3质粒提取 用质粒提取试剂盒对菌株中质粒进行提取，并用NanoDrop分光亮度计进行检测以确保有提取的质粒浓度达标，将提取好的质粒存放于-20 ℃环境中。

1.5.4基因分型 分别用CTX-M、TEM、OXA和SHV这4种不同的引物对产ESBLs大肠埃希菌的质粒进行扩增，并配以阳性对照、阴性对照及空白对照，反应条件参照参考资料[8-10]，引物序列参照表1。

1.5.5初步分群 用RFLP的方法对CTX-M的PCR扩增产物用PstI和PvuII进行切割，反应条件参照参考文献[8]，之后将其电泳结果与文献[8]进行对比，从而完成CTX-M分群。

表1 基因引物序列及扩增片段长度Tab.1 Primer sequences of genes and amplicon size

2 结 果

2.1产ESBLs菌株检测结果 69个鸡源性产品中有62个产品检测出了产ESBLs大肠埃希菌，共分离出103株。

2.2产ESBLs基因分型结果 103株产ESBLs大肠埃希菌中，同一产品检出基因型完全相同的菌株, 视为来自同一克隆, 最后非重复株有84株，其中CTX-M型、TEM型、OXA型和SHV型检出率分别为98.8%(83/84)、25.0%(21/84)、3.6%(3/84)和0.0%(0/84)；其中23.80%(20/84)同时携带CTX-M型和TEM型，3.6%(3/84)同时携带CTX-M型和OXA型。ESBLs 4种分型PCR产物电泳结果见图1；菌株得出ESBLs分型PCR产物电泳结果见图2。

2.3初步分群结果 83株CTX-M型的产ESBLs大肠埃希菌中66.3%(55/83)为CTX-M-G1，31.3%(26/83)为CTX-M-G9，CTX-M-G2和CTX-M-G8的检出率均为1.2%(1/83)。部分CTX-M型分群酶切后电泳结果，见图3。综合84个非重复菌株基因分型结果见表2。

M为100 bp DNA Marker；1为CTX-M；2为 TEM；3为OXA；4为SHV(Klebsiella pneumoniae ATCC 700603)图1 4种基因分型PCR产物电泳结果Fig.1 Genotypes of four types ESBLs

M为100 bp DNA Marker；1为CTX-M；2为TEM；3为OXA图2 菌株得出ESBLs分型PCR产物电泳结果Fig.2 PCR results of ESBLs isolates

2.4药敏试验 84个非重复株对12种测试药物的耐药情况结果见图4。对氨苄西林耐药率最高达98.8%(83/84), 其次为四环素83.3%(70/84)和阿米卡星78.6%(66/84), 碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南均未出现耐药情况。对第三代头孢菌素的耐药程度不一, 其中以头孢噻肟最高38.1%(32/84), 头孢曲松次之34.5%(29/84), 而头孢他啶最低10.7%(9/84)。 对4种以上抗生素的耐药菌株占83.3%(70/84), 多重耐药情况严重。

M为100 bp DNA Marker；1为 CTX-M-G1；2为 CTX-M-G2；3为 CTX-M-G8；4为CTX-M-G9。图3 部分CTX-M型分群酶切后电泳结果Fig.3 RFLP result of CTX-M positive isolates

表2 84株产ESBLs 大肠埃希菌菌株基因分型检测结果(n=84)Tab.2 Genotype of 84 isolates ESBLs producing E.coli

注: AMP为氨苄西林; CTX为头孢噻肟; CAZ为头孢他啶; CRO为头孢曲松; FOX为头孢西丁; GEN为庆大霉素; AMK为阿米卡星; CIP为环丙沙星; TCY为四环素; TZP为哌拉西林; IMP为亚胺培南; MEM为美罗培南图4 鸡源大肠埃希菌菌株对药物的耐药率Fig.4 Antibiotic susceptibility patterns of Escherichia coli isolates from chicken

3 讨 论

本研究通过药敏试验的方式对鸡源性产品中产ESBLs大肠埃希菌进行检测，结果显示出澳门地区鸡源性产品中ESBLs占比高达89.8%(62/69)，相比中国其他地区，如哈尔滨79.6%[11]、青岛83.1%[12]、河南62.8%[13]及香港72.0%[14]，澳门地区的检出率最高，可能因为这些鸡源性产品是用集中屠宰的方式进行屠宰，且加工过程中工具可能受到耐药菌的污染，导致整个生产线受到污染，使所有鸡源性产品都带有耐药菌，而其他地区的研究是包括活鸡及冻鸡，活鸡含菌量虽然高，但通常单独屠宰，推测交叉污染的机会比处理好的鸡源性产品少。通过PCR的方法对产ESBLs大肠埃希菌进行基因分型，根据结果可知主要基因型为CTX-M型，其检出率为98.8%，该数据与2010年中国鸡源性产ESBLs大肠埃希菌CTX-M型检出率96.43%[15]、2011年广东地区CTX-M型检出率83.4%[16]的数据相似。其他地区如哈尔滨CTX-M型流行率为71.5%[11]、青岛CTX-M型流行率为100%[17]、河南CTX-M型流行率为89.8%[13]，说明澳门地区和中国内地的鸡源性产ESBLs大肠埃希菌主要流行的基因型均为CTX-M型。但澳门地区的数据与辽宁的数据不相似，辽宁的鸡源性产ESBLs大肠埃希菌的主要流行基因型为TEM型，其检出率为100%[13]，而澳门地区TEM型的检出率为25.0%，这说明了不同地区的耐药基因型流行率间存在差异，可能是地域不同或抗生素的使用方法不同。同时本次研究还分别用PstI和PvuII这2种限制性内切酶对大肠埃希菌的CTX-M型基因扩增产物进行切割，根据切割结果可知其主要流行型为 CTX-M-G1型66.3%，其次为CTX-M-G9型31.9%，此数据也与山东[18]和深圳[19]CTX-M型大肠埃希菌中主要以CTX-M-G1和CYX-M-G9为主的数据相符。

产ESBLs细菌除了对第3代头孢菌素耐药外, 质粒上同时携带其他耐药基因, 对氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等抗菌药物交叉耐药, 本实验结果显示, 84个非重复株除了碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南均未出现耐药情况外, 呈现4种以上耐药占83.3%, 5种以上耐药占54.7%, 可见多重耐药的大肠菌株在澳门市售鸡源性产品普遍检出，容易通过食物链传递给人, 造成公共卫生的风险。澳门地区因禽流感的原因而限制活鸡的进口，故澳门地区无活鸡只有冰鲜鸡或急冻鸡，追溯这些冰鲜鸡和急冻鸡的来源可知它们分别来自9个不同食品公司加工厂。根据实验数据可知不同鸡场的基因流行率存在差异，这可能是因为不同鸡场对抗生素的使用方式不同或在对鸡源性产品的处理时有污染而导致的。为进一步探讨本次实验的数据与健康人群肠道中产ESBLs大肠埃希菌的流行率的相关性，需将两者数据进行对比，进而了解两者间的关联。从而提高人们对耐药菌株的产生的关注度，重视耐药基因型的特征，做到合理使用抗生素，以降低耐药菌的检出率。

利益冲突：无