广州市鼠形动物肠道产ESBL大肠埃希菌分布及病原特征分析

徐建敏，侯水平，张 晶，陶 霞，白志军，吴新伟，周 勇

大肠埃希菌是临床和社区感染最常见的机会致病菌，同时其耐药性问题也越来越突出。中国细菌耐药性监测网报道2005-2014年各监测医院分离大肠埃希菌对头孢噻肟和头孢他啶的耐药率显著提升[1]。大肠埃希菌对头孢类抗生素的耐药机制主要是产生超广谱beta内酰胺酶(ESBL)，在我国ESBL最常见的型别是CTX-M型[2]。

除了人，动物也是产ESBL大肠埃希菌的重要储存宿主。养殖动物检出产ESBL大肠埃希菌的比率往往比人更高[3]。近年来野生动物检出ESBL大肠埃希菌也越来越受到关注，人社区周边的野生动物受人类活动影响易从人类排放的污水、丢弃的垃圾以及医疗废物等获得人的耐药菌[4-5]。鼠形动物是一大类外形相似、习性相近多个种类哺乳纲动物的统称，包括一些啮齿目和食虫目动物，其分布广，数量众多。部分鼠形动物如啮齿目鼠科的家鼠和食虫目鼩鼱科的鼩鼱等习惯栖息于人的住房和各类建筑物中或周围，与人类共处于同一生活环境，接触频繁，是多种人兽共患的传染性细菌、病毒和寄生虫感染的传染源。社区环境中的鼠形动物可以通过直接接触人群或间接接触食物、水源、污水管道等途径传播耐药性细菌和耐药基因。但国内对于鼠形动物携带ESBL大肠埃希菌的耐药机制研究较少，本文拟对广州某居民生活区捕获的鼠形动物肠道的ESBL大肠埃希菌进行鉴定，分析鼠形动物肠道ESBL大肠埃希菌的耐药机制并对菌株进行分子分型。

1 材料与方法

1.1样本收集 2016年9-11月，选择广州市城区内某居民区捕鼠。鼠笼布置地点为建筑物墙边、下水道、垃圾桶、水沟等地点；以“晚放晨收”形式每月捕鼠1次，连续捕鼠3个月。对捕获老鼠麻醉后处死，然后解剖鼠取肠道标本。

1.2材料与仪器 Viteck2 compact全自动细菌鉴定仪购自法国生物梅里埃公司；EC增菌肉汤购自OXID公司；SSI肠道分离平板为丹麦SSI产品；革兰阴性菌鉴定卡以及革兰阴性菌药敏分析卡购自法国生物梅里埃公司；头孢噻肟购自Sigma公司；PCR引物以及PCR产物测序由上海美吉生物科技公司完成。

1.3培养与分离 将肠内容物样本加入含4 μg/mL头孢噻肟的EC增菌肉汤30 mL中培养18～24 h，然后接种至含4 μg/mL头孢噻肟的SSI肠道分离平板培养18～24 h。从SSI肠道平板上挑取红色的单个菌落到血平板上培养后再使用Viteck 2 compact全自动细菌鉴定仪进行菌种鉴定。

1.4药敏实验 选择AST-GN04革兰阴性菌药敏分析卡在Vitek 2 compact全自动微生物鉴定仪上对分离菌株进行抗生素敏感性分析，AST-GN04卡包含以下抗生素：青霉素类(氨苄西林、哌拉西林)；头孢类(头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶)；单环-β内酰胺类(氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)；氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)；喹诺酮类(环丙沙星、左氧氟沙星)和碳青霉烯类(亚胺培南)共14种抗生素。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC 700603、大肠埃希菌ATCC35218和大肠埃希菌ATCC 25922。

1.5超广谱β-内酰胺酶(ESBL)表型确认 经Vitek 2 compack药敏实验鉴定为可疑产ESBL菌落，按照美国CLSI 2016中推荐的产ESBL表型确认实验进行验证。采用双纸片协同法，按CLSI要求进行，判定标准按2016版CLSI标准：头孢噻肟-头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶-头孢他啶/克拉维酸2对纸片中的任一对，含克拉维酸和不含克拉维酸纸片之间抑菌圈差≥5 mm即为阳性。

1.6ESBL耐药基因检测 对于blaCTX-M基因，先使用多重PCR检测blaCTX-M的5个亚群，再针对每个亚群使用单重PCR检测其全片段，然后送测序，结果通过Blast比对分析其具体blaCTX-M基因亚型[6]。OXA、SHV和TEM基因的引物和扩增参照文献进行[7-8]。

1.7多序列位点MLST分型 在MLST官网上http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli获取针对大肠埃希菌7个管家基因的引物序列和PCR扩增条件，7个管家基因包括：adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA，PCR产物测序后将序列片段在官网上提交并获得相应的ST型[9]。

1.8脉冲场凝胶电泳PFGE分型 参照国际食源性致病菌病原细菌分子分型监测网络 (PulseNet) 中非O157 PFGE分型的标准操作方法进行。使用沙门菌H9812作为分子量Marker和质控菌。使用XbaⅠ限制性内切酶(50 U)，37 ℃酶切 2 h；电泳参数为6.76～35.38 s, 18 h；用BioNumerics 7.6软件对基因图谱进行聚类分析，生成聚类图谱。

2 结 果

2.1鼠形动物监测结果 2016年9～11月期间，连续捕鼠3个月，共布置鼠笼600个，共捕获鼠形动物123只，包括57只黄胸鼠、54只褐家鼠、11只臭鼩鼱和1只黑毛鼠。

2.2头孢噻肟耐药大肠埃希菌检出情况与耐药性分析 123份鼠形动物样本共成功分离35株耐头孢噻肟大肠埃希菌，检出率为28.5%，经ESBL表型确认全部是产ESBL菌株。其中褐家鼠16只，黄胸鼠13只，臭鼩鼱5只，以及黑毛鼠1只。35株产ESBL菌株对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星以及左氧氟沙星耐药率很高，分别为100%、91.4%、97.1%、100%、100%、88.6%、80%和74.6%。对头孢他啶的耐药率和中介耐药率分别是54.3%和45.7%。亚胺培南、阿米卡星、妥布霉素以及庆大霉素的耐药率较低，分别为2.9%，2.9%，8.6%和31.4%(表1)。

2.3ESBL耐药基因检测结果 35株菌一共检出CTX-M耐药基因37个，有2株菌携带了2种CTX-M耐药基因。检出blactx-m-7923株，blactx-m-556株，blactx-m-1234株，blactx-m-152株，blactx-m-65和blactx-m-27各1株。未检出OXA、SHV和TEM型ESBL基因。

2.4MLST 35株菌一共鉴定出23个ST型，其中较多的分别是CC206-ST206(4株)、CC10-ST10(3株)、ST457 (3株)、CC446-ST602 (2株)和ST6388 (2株)。详见表2。

2.5PFGE 35株菌，除一株菌的基因组DNA降解而没有获得条带外其余34株菌都获得条带，共获得34种带型，相似度为36.2%～96.3%。34株菌中包含2个PFGE带型相似度较高的簇，其中簇1包含4株菌，相似度为90.6%～96.3%，簇2包含2株菌，相似度为95.7%(图1)。

表1 35株产ESBL大肠埃希菌的抗生素敏感性分析结果(N=35)Tab.1 Antimicrobial susceptibility profiles of 35 ESBLs-producing E.coli isolates

表2 35株携带CTX-M基因的大肠埃希菌所属不同序列型和克隆系的数量Tab.2 Distribution of sequence types and CTX-M genes among blaCTX-M-containing E.coli isolates according to clonal complexes

图1 34株大肠埃希菌PFGE聚类图Fig.1 PFGE clustering diagram of 34 strains

3 讨 论

我们对广州市某居民区的鼠形动物产ESBL大肠埃希菌的检测结果显示ESBL阳性率高达28.5%，所有ESBL阳性菌株均携带CTX-M型基因。 Ho等对香港18个区的鼠形动物进行ESBL大肠埃希菌检测，发现不同区域之间检出率差别较大，有2个区无检出，有3个区检出率高达21%～50%[10]；ESBL菌株中携带CTX-M型占92%，MLST显示菌株遗传多样性。Guenther等[11]在德国柏林市区不同地点捕获了老鼠87只，检出67株产ESBL大肠埃希菌，阳性率高达77%。这些研究表明城市居民区鼠形动物携带的大肠埃希菌ESBL阳性率普遍都很高，说明鼠形动物可做为产ESBL大肠埃希菌的储存宿主。

最近，孟加拉的一篇报道从在医院周边垃圾堆觅食的乌鸦中分离到产ESBL大肠埃希菌。乌鸦携带CTX-M型ESBL大肠埃希菌的检出率高达59%，而且很多CTX-M型基因都是临床患者常见的型别，说明医院周边野生动物可以从人获得这些菌株或者CTX-M型基因[4]。国内钟雪珊报道了在广州市某三甲医院周边居民区鼠型动物携带肺炎克雷伯和铜绿假单胞菌的耐药情况。发现肺炎克雷伯菌的多重耐药率为40.9%，产ESBLs菌株检出率为10.7%。肺炎克雷伯菌与铜绿假单胞菌的耐药谱与目前临床患者菌株的耐药谱相似，提示这两种细菌可能在鼠形动物与人之间有传播[5]。由于医院周边环境易受医院环境的影响，因此本文选择远离医院的居民区进行鼠型动物耐药菌的研究。

本研究从捕获的123只鼠型动物分离到35株产ESBL大肠埃希菌，并从中检出CTX-M耐药基因37个。本研究检出的所有CTX-M耐药基因都曾在人临床患者分离的耐药菌株中检出，如blactx-m-15是欧美国家产ESBL菌株中最常见的ESBL基因[12]。blactx-m-65和blactx-m-55基因在国内人临床和健康人群较常见[13-14]，blactx-m-123近年来在国内人和动物都有检出[15]。blactx-m-79在本研究中占据优势地位，这一ESBL基因过去并不多见，但近年检出增多。2008年，田素飞等[16]首次报道在沈阳某社区老年健康人群中分离到blactx-m-79大肠埃希菌。此后美国也报道在农场的小牛粪便中分离到blactx-m-79大肠埃希菌[17]，瑞士在江水中分离到blactx-m-79大肠埃希菌[18]，但这些文章中检出的blactx-m-79大肠埃希菌数量都较少。本研究首次报道在鼠形动物中检出blactx-m-79且检出率较高。近几年，国内也报道blactx-m-79在家禽和宠物犬的产ESBL大肠埃希菌中占优势地位[19-20]。产CTX-M大肠埃希菌在动物与人群中的优势型别存在差异的原因还不明了，甄盼盼等[21]研究认为某些CTX-M基因可以和其它耐药基因特别是氨基糖苷类耐药基因位于同一质粒上发生共同转移，当动物养殖场使用氨基糖苷类抗生素，就易于筛选出产CTX-M大肠埃希菌并促进其扩散。blactx-m-79是否也存在这种因素，需后续对blactx-m-79基因的周围序列进行深入研究来证实。

MLST发现35菌株多达23个ST型，而PFGE的结果也显示带型分布较为分散, 无优势带型，表明这些鼠形动物携带的ESBL菌株的遗传多态性。目前的研究表明产ESBL大肠埃希菌携带的CTX-M基因大多位于细菌携带的质粒上，CTX-M基因可通过质粒在细菌之间水平转移，从而提高CTX-M基因的传播，需进一步实验证实鼠形动物产ESBL大肠埃希菌的CTX-M基因是否位于质粒上，并分析质粒的传播性以及鉴定耐药质粒特征。

综上所述，本文从123只鼠型动物检出35株ESBL大肠埃希菌，检出率高达28.5%，所有的ESBL基因型都是CTX-M型。本文检出的CTX-M亚型中最常见的是blactx-m-79，需要进一步研究来分析blactx-m-79在鼠形动物中传播的特征。MLST和PFGE的结果发现产ESBL大肠埃希菌菌株基因型呈现高度多态性。本研究结果表明鼠型动物是产ESBL大肠埃希菌的重要储存宿主。

利益冲突：无