细粒棘球蚴线粒体nad1基因的克隆与序列分析

于晶峰，桂 峥，武 琳，杨晓野，王 瑞，木 兰

细粒棘球蚴是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)的中绦期幼虫，是和人类接触密切、感染人类的主要寄生虫虫种。全球畜牧业地区和中国西部的广大地区，是细粒棘球蚴病(包虫病)的流行区[1-2]。随着我国经济模式的改变和各省之间流动人口数量增加，先后有27个省份报道过人患包虫病的病例，目前人感染细粒棘球蚴的病例数还在持续增加。到2018年包虫病已被我国列为强制免疫的5种疾病之一。以往关于细粒棘球蚴虫株的基因型分析和遗传进化特点，经常使用线粒体细胞色素氧化酶1(CO1)基因作为标记，阐明某一地区细粒棘球蚴虫株的所属基因型和遗传进化特点。前期查阅文献[3-4]发现线粒体氧化脱氢酶1(nad1)基因与CO1基因相比，具有较高保守性的同时，其结构更加精简、进化速度更快、种间蛋白基因序列差异更大。更加适合作为人体内寄生性绦虫进化分类的遗传学标记基因[5]。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1试验样品 本次研究中采集均来自于内蒙古锡盟西乌旗绵羊屠宰场以及锡林浩特市医院收治的细粒棘球蚴病患者。其中调查的羊群中包括成年和幼年绵羊，共2 313只，其中患羊数量30只，收治的细粒棘球蚴病患者均经病理证实。所有患者均对本次研究知情同意。采用注射器(10 mL)吸出囊包中的囊液，进行离心处理，时间为1.5 min，分离原头蚴和囊液，置于-20 ℃环境中待检。

1.1.2菌种、载体及主要试剂 选自天根(北京)生化科技有限公司生产的大肠杆菌Top10感受态细胞、血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304)，天根(北京)生化科技有限公司生产的琼脂糖胶回收试剂盒(DP209-03)，天根(北京)生化科技有限公司生产的pGM-T连接试剂盒(VT202-02)。选自大连宝生物工程有限公司生产的宝生物染料法荧光定量试剂盒、DL2000 DNA Marker、氨苄青霉素(Amp)以及大连宝生物工程有限公司生产的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、10×Loading Buffer。选择北京市赛百盛基因技术有限公司生产的核酸染料以及内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学研究室提供的氢氧化钠等常规生化试剂。

1.2基因组DNA提取及PCR扩增 严格按照说明书要求操作，提取细粒棘球蚴原头蚴基因组DNA。根据Yang JK等[6]的相关研究中的细粒棘球蚴nad1基因的引物序列，上游引物(nad1-F):5′-GGTGGTTGTTTTTGGGTTAG-3′和下游引物(nad1-R): 5′-GTTTGCTATTGTTAATTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

目的基因扩增以提取的细粒棘球蚴原头蚴基因组DNA为模板各组分用量: Premix Taq 40 μL，nad1-F 4 μL，nad1-R 4 μL，模板4 μL，dH2O补足至80 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s， 35个循环；72 ℃完全延伸10 min。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，紫外灯下观察结果，并采用照相系统对试验结果进行记录。

1.3扩增片段的克隆与测序 PCR产物纯化，严格按照说明书操作。采用电泳后DNA凝胶回收的纯化方法。按照pGM-T载体的说明书，连接PGM-T载体与回收的PCR产物(见表1)。载体与目的片段的摩尔比控制在1∶3～1∶8。在20 μL连接体系中16 ℃水浴连接过夜。反应完成后将PCR管迅速放于冰上获得所需要的结果。

表1 连接反应Tab.1 Connection reaction

载体和PCR产的连接后，转入处于能吸收周围环境中DNA分子生理状态的微生物细胞中，感受化细胞后，过夜培养，进行蓝白斑筛选,挑取白色重组菌落，过夜培养后提取质粒，最近的一次转化，置于2 mL LB液体培养基中(含有Amp)，150 r/min，37 ℃振荡培养12～16 h，用无菌枪头取1 μL进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系为20 μL，反应条件同1.2的PCR扩增。菌落PCR检测重组转化结果，阳性菌液送检。

1.4序列分析 按照15种绦虫线粒体nad1基因相关资料表进行同源搜索。对序列覆盖率、最大序列相似度、随机匹配可能性等3个要因素进行综合考虑，选取圆叶目、裂头目、原头目等其他科属种的nad1基因的序列，运用DNAstar 软件计算序列间的相似性，计算不同的种群或种之间的基因差异的程度，即遗传距离。构建系统发育树采用MEGA4.0软件的最大似然法和邻接法完成，系统发育树(phylogenetic tree)进行自居检验，设定循环次数为1 000次。

2 结 果

2.1PCR扩增结果 以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图1。结果表明nad1基因在约895 bp 处获得了特异性条带，与预期片段大小吻合，无非特异性的扩增条带(见图1)。

M.DL-2000分子量标记；1.西乌旗样本；2～7.锡林浩特样本；8.阴性对照图1 细粒棘球蚴nad1基因PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of nad1 gene from Echinococcus granulosus

阴影部分分别为上下游引物；M.DL-2000分子量标记；1.西乌旗样本；2～7.锡林浩特样本；8.阴性对照图2 阳性克隆菌液PCR鉴定电泳结果Fig.2 Electropherogram of positive clone bacterium by PCR amplification

2.2克隆结果 阳性菌液经PCR鉴定和1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在800～1 000 bp之间出现了清晰的特异性条带(见图2)。

2.3 测序结果细粒棘球蚴nad1序列

2.3.1西乌旗羊株nad1序列 西乌旗羊株细粒棘球蚴以nad1-F、nad1-R为引物，通过PCR扩增获得了nad1基因部分序列，经处理获得了长度为895 bp的序列，其中A的含量为19.44%，G的含量为25.92%，T的含量为46.59%，C的含量为8.04%， A的含量与T的含量相加为66.03%。

2.3.2锡林浩特市人株细粒棘球蚴nad1序列 锡林浩特市人株测序所得的序列长度也为895 bp，其A含量为19.44%，G的含量为25.92%，T的含量为46.82%，C的含量为7.82%，其中A的含量与T的含量相加为66.26%。

2.3.3序列比对结果 本次研究结果提示，内蒙古锡盟西乌旗羊株nad1基因序列与G1型nad1基因序列相同，而G1型nad1基因序列与锡林浩特市医院收治的细粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列与之间存在2个变异位点，这一结果提示二者均为G1基因型。

采用ncbi Blastp对本次研究中获得的nad1序列进行同源分析，结果表明，内蒙古锡盟西乌旗羊株nad1基因序列与锡林浩特市医院收治的细粒棘球蚴病患者人株nad1基因序列完全相同，基因型均为G1型。

2.3.4基因序列同源性与遗传距离分析 内蒙古地区羊株nad1基因序列长度均为895 bp，而人株nad1基因序列长度也为895 bp，同源性分析结果提示二者细粒棘球蚴nad1序列完全相同，且将圆叶目、带绦虫科的加拿大棘球绦虫的nad1序列与细粒棘球蚴nad1序列进行同源性分析，结果提示，相似性较高，可达到86.5%，而与圆叶目、带绦虫科的加拿大棘球绦虫的基因差异程度很少，遗传距离仅为0.139。与NCBI获得的绦虫科的的基因差异程度提示遗传距离范围为0.139～1.511，与肥胖带绦虫的基因差异程度最大，平均遗传距离为0.8。

采用MP法和NJ法构建的系统发育树结果显示细粒棘球蚴nad1序列与带绦虫科的加拿大棘球绦虫、多房棘球绦虫位于同一分支，系统发育树的自展值(Boostrap)均为100%(图3、图4)。细粒棘球蚴nad1序列所属分支与裂头目、裂头科Diplogonoporus balaenopterae所属分支相隔最远(图3、图4)。

图3 基于nad1构建的13种绦虫之间的系统发育树(MP-Maximum Parsimony法)Fig.3 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

图4 基于nad1构建的13种绦虫之间的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed between 13 kinds of tapeworm based nad1

3 讨 论

细粒棘球蚴病主要见于畜牧业比较发达的地区，其感染率的高低与多种因素密切相关，如生活习惯、气候、居住条件以及自然条件等等。细粒棘球蚴的宿主适应性比较广泛，其分布非常广泛，世界各大洲牧区均可见其分布,在偶蹄类家畜以及犬动物之间循环的特点，而在我国绵羊/犬动物循环，有些寄生虫能逃避宿主的免疫效应，在与宿主长时间的适应过程中发生了变异，有些寄生虫在宿主体内寄生虫时,其表面抗原性发生变异,直接影响免疫识别。国内外相关研究表明，全球范围内将细粒棘球绦虫划分为10个基因型，我国主要以G1、G3、G6、G8型为主[7-8]。

细粒棘球绦虫成虫及其幼虫严重危害人类健康和畜牧业发展，而研究表明，细粒棘球绦虫的虫株的鉴定难度很大，虽然对细粒棘球绦虫的虫株的分化特征和形态特征可以通过生物学以及形态学进行鉴定，但是鉴定过程中的影响因素较多，如宿主、环境等，均会影响鉴定结果，这一结果也提示基因水平上的差异并不是十分全面。进化都是以种群为单位的,所以单个生物的DNA序列是看不出进化信息的，由于DNA序列含有丰富的进化信息，甚至个别物种的基因组具有多于106碱基对，稳定性较高，组成DNA的碱基只有4种:ATCG,所以不同生物的碱基是相同的但不同生物的DNA碱基序列是不相同的[9-10]。因此，通过DNA序列进行分析来鉴定不同种生物体、亚种及地理株是具有重要的意义的[9-11]。

我们实验室以往的研究表明：内蒙古两个地区人株和羊株细粒棘球蚴CO1基因变异率均在1%以下，这种较明显的株内变异现象，与新疆、甘肃和青海地区细粒棘球蚴基因型的变异情况大体相似(杨俊克等[6]文献)。我们利用nad1基因作为遗传标记，测得细粒棘球蚴内蒙古株的基因型也为G1型。与利用CO1基因作为标记得出的结论一致。并且生物遗传学结果表明：用nad1基因做标记，序列差异大于 CO1基因种间序列差异，基于nad1基因的这一特点，可以被广泛应用于研究多种动物性寄生虫的种内和种间遗传变异[12]。 由此可知：nad1的变异率还是比较低的，其基因较保守，基因突变一般是由于碱基的增添和缺失，但一般情况下不会发生缺失和插入，在一定程度上基因变异倾向于嘌呤被嘌呤替换或嘧啶被嘧啶替换，不是碱基对被另一个碱基对代替。本实验也得出相同的结论，锡林郭勒盟锡林浩特市人株nad1基因序列，存在2个变异位点，为T与C转换。样品DNA序列里，碱基A+T含量约为66%，略高于魏玉环等[13]的报道。

本次研究中，通过对不同绦虫nad1基因序列进行对比，结果提示我们虽然基因序列在种内相对保守，又存在一定的种间差异,可作为带属绦虫分类鉴定。如将细粒棘球蚴与同属带绦虫科的加拿大棘球绦虫进行同源性分析，结果显示同源性较高，达到了86.5%，而将演化关系较为疏远的Diplogonoporus balaenopterae进行同源性分析，结果显示同源性仅为75.2%。这一结果与CO1基因的进化分析结果十分相似。CO1的基因分析结果与nad1的基因进化分析结果均将细粒棘球蚴与加拿大棘球绦虫化到了同一个分支，这一研究结果提示我们细粒棘球蚴与加拿大棘球绦虫二者间发生分歧的时间较短，可能在生活习性方面还存在某些相似性。

利益冲突：无