棉蚜取食对苗期棉花游离氨基酸含量的影响

马妍，张帅，雒珺瑜，朱香镇，高雪珂，崔金杰

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

棉蚜Aphis gossypii（Glover）属半翅目蚜科，其分布广泛，个体小，繁殖快，是棉田重要的刺吸害虫[1]。 大量棉蚜若虫和成虫集中在棉叶背面和幼茎上吸食寄主植物汁液，造成棉花叶片畸形卷缩，植株矮小，严重的可使幼苗枯死。 此外，棉蚜分泌蜜露诱发煤污病，影响植物光合作用，还能传播多种植物病毒，间接降低作物产量和品质[2]，对棉花生产造成了重大经济损失[3]。

游离氨基酸是植物韧皮部汁液中的主要营养物质之一，能调节多种植物生理过程，包括离子运输、气孔开放，影响某些酶的合成与活性等[4]，还是许多植物次生代谢物的前体， 在信号传导、防御、光保护等方面具有重要作用。 同时，棉蚜以氨基酸为氮素基础合成自身所需的各种物质，棉花叶片内的氨基酸含量与棉蚜的生存密切相关，氨基酸含量越高，棉蚜生物量越高[5]。转入外源基因（如Bt 基因）也影响棉花体内氨基酸的合成与利用，间接影响棉蚜的生长发育[6]。 此外，棉花体内氨基酸与抗蚜性可能有一定关系[7]。据报道，棉花生长各时期含量最高的4 种氨基酸依次为谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸，含量最低的3种依次为胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸[8]。棉花内的缬氨酸和脯氨酸能影响棉蚜种群消长，天冬氨酸和丝氨酸可能对棉蚜翅型分化率有影响[9]。

游离氨基酸的含量变化能反映寄主植物与昆虫的相互作用以及昆虫如何适应寄主植物的营养水平改变[10]，目前已有大量研究关注寄主植物游离氨基酸与刺吸昆虫取食的相互作用。 研究发现，豌豆蚜取食导致蚕豆韧皮部总氨基酸含量上升了74.97%， 多种氨基酸含量均显著升高[11]。棉黑蚜为害造成棉株抗性提高，伴有脯氨酸含量上升[12]。此外，有研究认为蚜虫密度和为害时间对感染叶片的游离氨基酸响应有显著的交互作用，高密度蚜虫为害后，叶片氨基酸含量大量增加达到峰值[13]。

目前，尚未见关于棉蚜取食活动对棉花游离氨基酸影响的报道，本研究计划通过采集田间棉蚜为害至不同受害等级的棉株，测量其不同组织中的游离氨基酸组成及含量变化，为深入了解棉花防御与棉蚜适应寄主的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料来源

试验材料均采集自中国农业科学院棉花研究所东场试验田（河南省安阳县）。试验田于2019年4 月底统一播种， 棉花品种为中棉所79，6 月初进行试验材料采集，其间未施用过任何肥料和农药，田间水分条件一致。 采集样品时，棉苗均生长至3 片真叶期，棉蚜为自然虫源。

1.2 材料的采集

按照五点采样法， 选取试验田2 条地中的5个地点，并按蚜害分级标准随机采集田间不同受害等级棉苗[14]，即：0 级，无棉蚜，叶片平展；1 级，有棉蚜，叶片无受害；2 级，有棉蚜，受害最重叶片皱缩或微卷近半圆；3 级，有棉蚜，受害最重叶片卷曲达半圆或半圆以上，呈瓢形；4 级，有棉蚜，受害最重叶片完全卷曲，呈球形。 每个受害等级分别采集12 株（周围4 个点每点采集2 株，中间点采集4 株），采集完成后使用无菌水冲洗叶片，擦干后用剪刀分离子叶、真叶、胚轴和根。

1.3 游离氨基酸的提取与分析

每个新鲜样品称取0.5 g，经液氮速冻，加入5 mL 体积分数2%的磺基水杨酸低温研磨至匀浆状，静置提取0.5 h 以上；摇匀后过滤，吸取适量滤清液，104r·min－1离心10 min， 抽取上清液过孔径0.22 μm 滤膜后备用。

使用氨基酸分析仪S433D（塞卡姆Sykam 科学仪器有限公司） 进行氨基酸样品的上机分析。氨基酸分析仪将样品中的游离氨基酸依次从分离柱上洗脱， 以茚三酮为柱后衍生物在波长440 nm 和570 nm 下检测游离氨基酸的保留时间与峰值。 将样品色谱图与标准样品色谱图进行校准（标准品与样品上样量相同），保留样品色谱图中有明显波峰的游离氨基酸或衍生物，经过计算得到每个样品中游离氨基酸含量，结果以每克新鲜样品中游离氨基酸的质量（μg）表示。

不同组织在不同受害等级的游离氨基酸含量，其差异显著性使用SPSS 23 中的非参数比较（Kruskal-Wallis 法）进行检验。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸组成及含量变化

通过对不同棉花组织（真叶、子叶、胚轴、根）的游离氨基酸组成分析，发现不同组织中游离氨基酸组成一致， 均检测到21 种游离氨基酸。 其中： 棉蚜的必需氨基酸 （Essential amino acids，EAA）10 种，有苏氨酸Thr、缬氨酸Val、甲硫氨酸Met、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、组氨酸His、色氨酸Trp、赖氨酸Lys、精氨酸Arg；其余11 种包括氨基酸衍生物为非必需氨基酸（Non-essential amino acids，NEAA）， 包括磷酸丝氨酸pSer、天冬氨酸Asp、丝氨酸Ser、天冬酰胺Asn、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、酪氨酸Tyr、γ-氨基丁酸γ-Aba、鸟氨酸Orn、脯氨酸Pro。

棉花组织受到棉蚜为害后，子叶、胚轴和根的游离氨基酸总量上升，在不同受害级别间达到差异显著水平。 其中：胚轴中的游离氨基酸总量在受害等级3、4 级剧烈上升， 受害等级4 级（9 172.1 μg·g－1）游离氨基酸总量是0 级（3 808.3 μg·g－1）的2.4 倍；根的游离氨基酸总量随受害等级增加逐渐升高，受害等级4 级（5 732.8 μg·g－1）是0 级（2 884.0 μg·g－1）的2.0 倍；子叶的游离氨基酸总量在受害等级3 级（2 338.9 μg·g－1）时含量最高，是0 级（1 131.9 μg·g－1）的2.1 倍。 真叶中游离氨基酸总量在受棉蚜取食后也有所增加，但未达到差异显著水平（P＞0.05），含量最低为0级2 366.3 μg·g－1， 最高为受害等级4 级2 994.0 μg·g－1。

图1 棉花组织中不同受害等级游离氨基酸含量Fig. 1 Total amount of free amino acids in cotton tissues with different damage grades

2.2 真叶中游离氨基酸变化分析

在受害的棉花真叶中， 必需氨基酸含量从0级 到4 级 的 含 量 分 别 为701.1 μg·g－1、1 047.1 μg·g－1、895.5 μg·g－1、625.6 μg·g－1、778.6 μg·g－1， 占游离氨基酸含量的百分比分别为29.6%、35.3%、31.0%、22.9%、26.0%； 在真叶的不同受害等级中，含量较高的游离氨基酸是γ- 氨基丁酸、天冬酰胺和丙氨酸，均为非必需氨基酸，必需氨基酸中含量较高的是精氨酸和苏氨酸，而含量较低的是组氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸。

与未受害的棉花相比， 真叶中天冬酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸含量上升达差异显著水平（P＜0.05），其他游离氨基酸含量略上升但差异不显著（表1）。 差异显著的5 种游离氨基酸在棉蚜取食后的最高含量与0 级真叶含量相 比 上 升 了1.3 倍、1.9 倍、0.8 倍、1.3 倍 和0.6倍。 含量显著下降（P＜0.05）的有3 种氨基酸：丝氨酸、 天冬氨酸、 精氨酸， 与0 级相比降低了32.1%、47.9%和66.3%。 精氨酸和丝氨酸虽然随着受害等级增加而显著下降， 但在受害等级为1级时含量上升超过0 级真叶，然后从2 级以上开始显著下降且2 级含量低于未受害真叶。

表1 不同受害等级棉花真叶中的游离氨基酸含量Table 1 Content of free amino acids in euphyllas of cotton with different damage grades

表1 （续）Table 1 (Continued)

2.3 子叶中游离氨基酸变化分析

子叶受棉蚜取食后，从0 级到4 级，必需氨基酸 含量 分别为233.1 μg·g－1、290.0 μg·g－1、321.0 μg·g－1、322.5 μg·g－1和310.5 μg·g－1，百分比分别为20.6%、22.0%、16.2%、13.8%、15.6%，必需氨基酸含量上升但百分比下降，非必需氨基酸含量在受害等级3 级时显著上升（P＜0.05）。在子叶的不同受害等级中，含量较高的4 种氨基酸是天冬酰胺、γ- 氨基丁酸、丙氨酸和天冬氨酸，均为非必需氨基酸，而必需氨基酸中含量较高的也是亮氨酸、苏氨酸和精氨酸，含量较低的4 种氨基酸在不同等级中均是甲硫氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和组氨酸。

受害子叶中，大多数游离氨基酸含量增加但没有达到差异显著水平（P＞0.05）；随着受害等级增加，含量上升达到差异显著水平（P＜0.05）的氨基酸为天冬酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸，这5 种游离氨基酸在棉蚜取食后的最高含量与0 级子叶相比上升了3.9 倍、3.5 倍、1.5倍、0.5 倍和1.1 倍（表2）。

2.4 胚轴中游离氨基酸变化分析

胚轴中游离氨基酸的含量在受棉蚜取食后显著上升， 从0 级到4 级的必需氨基酸含量为299.7 μg·g－1、373.2 μg·g－1、504.1 μg·g－1、678.3 μg·g－1和855.5 μg·g－1， 百分比分别为7.9%、10.4%、9.9%、8.1%和9.3%。 在胚轴的不同受害等级中，含量较高的4 种氨基酸是天冬酰胺、谷氨酸、γ- 氨基丁酸和天冬氨酸，均为非必需氨基酸，而必需氨基酸中含量较高的是精氨酸、苏氨酸和亮氨酸，含量较低的3 种氨基酸在不同等级中均是甘氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸。

棉花胚轴受害后，随着受害等级增加，多种游离氨基酸的含量上升达到了差异显著水平 （P＜0.05），包括磷酸丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸，这9 种游离氨基酸在棉蚜取食后的最高含量与0级胚轴含量相比分别上升了0.4 倍、0.6 倍、2.0 倍、3.1 倍、15.3 倍、1.2 倍、2.7 倍、0.7 倍和1.0 倍，其中精氨酸含量剧烈上升， 从30.4 μg·g－1上升到了496.0 μg·g－1； 另外， 脯氨酸和苯丙氨酸含量与0级相比分别降低了34.8%和29.9%（表3），且苯丙氨酸含量下降达到了差异显著水平（P＜0.05）。

2.5 根的游离氨基酸变化分析

根中的必需氨基酸所占游离氨基酸含量的百分比最低，从0 级到4 级的必需氨基酸含量分别为161.5 μg·g－1、197.8 μg·g－1、216.1 μg·g－1、241.5 μg·g－1和248.4 μg·g－1， 百分比分 别 为5.6%、5.0%、4.9%、5.0%和4.3%。在不同受害等级中， 根中含量较高的5 种氨基酸是天冬酰胺、谷氨酸、γ- 氨基丁酸、天冬氨酸和丝氨酸，均为非必需氨基酸， 而必需氨基酸中含量较高的是苏氨酸，含量较低的氨基酸均是鸟氨酸和甲硫氨酸。

表2 不同受害等级棉花子叶中的游离氨基酸含量Table 2 Content of free amino acids in cotyledons of cotton with different damage grades

根受害后游离氨基酸含量上升，但多数没有达到差异显著水平（P＞0.05）； 随着受害等级增加， 含量上升显著的游离氨基酸为天冬酰胺、谷氨酸和异亮氨酸，这3 种游离氨基酸在棉蚜取食后的最高含量与0 级含量相比分别上升了1.3倍、1.3 倍和1.6 倍（表4）。

3 讨论与结论

蚜虫是典型的刺吸式害虫，通过口针刺入韧皮部吸食植物汁液获取营养。 蚜虫口针刺入的同时会分泌大量的唾液，唾液中含有多种酶类帮助溶解植物组织并阻止伤口愈合，因此可以不断地取食植物汁液[15]。 植物对蚜虫取食的反应是激活防御基因[16]，比如通过产生次生代谢物来阻止蚜虫取食的直接防御和释放特定挥发物来吸引蚜虫天敌的间接防御等[17-18]。 实际上，营养关系是联系寄主植物与蚜虫相互作用的纽带，营养物质的变化能体现寄主植物与蚜虫的相互作用以及蚜虫对寄主植物营养条件的适应。 研究发现，植株含氮量的高低对蚜虫的活动有一定的影响，蚜虫偏好取食氨基酸含量高的脱落叶片，而且营养品质高的叶片有利于蚜虫生长发育[19]。 在昆虫血淋巴中，游离氨基酸的变化取决于消化和吸收的营养物质，也取决于本身的内部代谢。 昆虫所需的大部分氨基酸可以从消化的食物中获得，其中精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸从营养上来说是必需氨基酸；游离氨基酸的含量不仅反映其在营养来源中的有无，而且有些游离氨基酸的含量可以被高度调节[20]。 游离氨基酸含量的多少直接影响植物寄主对蚜虫的敏感程度，如棉花叶片的含氮量或可溶性氨基酸含量与棉花抗蚜性

呈正相关[21]。

表4 不同受害等级棉花根中的游离氨基酸含量Table 4 The content of free amino acids in roots of cotton with different damage grades

本研究中，棉花组织受害后游离氨基酸总量上升，子叶、胚轴和根组织中的游离氨基酸总量最高时是未受害棉花的2.4 倍、2.0 倍和2.1 倍，并达到差异显著水平。 非必需氨基酸在各个组织的含量显著上升，必需氨基酸仅在胚轴中含量上升显著；此外，必需氨基酸占游离氨基酸含量的百分比较低，且在子叶和真叶受害组织中有百分比下降的现象。 不同棉花组织中含量上升达显著水平的游离氨基酸种类并不一致，真叶中为天冬酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和鸟氨酸；子叶中为天冬酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸和γ-氨基丁酸；胚轴中较多，包括磷酸丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸和鸟氨酸；根中仅有天冬酰胺、谷氨酸和异亮氨酸。 这一结果说明，棉蚜取食诱导寄主棉花产生或吸收了大量游离氨基酸，从植物根部和胚轴运送到真叶和子叶[22]，而棉蚜在叶片的直接取食和棉花自身的代谢反应等因素可能影响了不同组织受害后单个游离氨基酸含量变化。棉蚜取食后， 棉花植株产生了大量非必需氨基酸，谷氨酸和天冬酰胺的大量增长是非必需氨基酸显著上升的主要原因，它们可被转化为其他必需氨基酸然后被植物利用，与豌豆蚜为害蚕豆植株后改变植株氨基酸组成的结果一致[23]。同时，植物组织中低含量的必需氨基酸使刺吸昆虫需要大量取食，并且借助体内的共生微生物提高氨基酸的吸收和转化效率[24]。 目前已证实初生共生菌Buchnera[25]可为宿主蚜虫提供多种必需氨基酸[26]。此外，棉蚜携带传播的病毒也被发现有利于蚜虫获取营养[27]，感染病毒后寄主植物叶片可溶性氨基酸含量能增加2 倍以上[28]。 共生模式能提高刺吸昆虫对外源氨基酸的利用率，使其能够适应寄主营养的改变[29]。

迄今的研究表明，刺吸昆虫会根据不同的寄主植物和不同的生理需要，通过改变唾液组分来达到取食和发育的目的[30]。 蚜虫唾液腺分泌的蛋白质或小分子可以抑制植物的防御反应，改变植物的生长过程，从而促进蚜虫的繁殖[31]。 本研究中，在棉蚜取食后，棉花组织中天冬酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、鸟氨酸等游离氨基酸含量变化较大。 其中，异亮氨酸被研究发现影响蚜虫的生长发育，当其缺乏时会造成蚜虫体质量显著降低[32]。 亮氨酸和甲硫氨酸的含量上升则被证明能增强绿色型豌豆蚜雷帕霉素（Target of rapamycin，TOR）信号通路的靶点，进而通过促进卵黄质素的合成来提高蚜虫生殖能力[33]。 而在绵蚜（Tetraneura sp.）取食产生虫瘿的试验中发现，虫瘿中的天冬酰胺含量显著上升以及总氨基酸含量高的品种倾向于产生更多后代[34]。另外有研究报道，棉株中的游离脯氨酸是重要的抗蚜物质，在棉花品种固有抗蚜性及诱导抗蚜性中有明显作用[35]；但也有研究认为脯氨酸的含量积累是响应水分胁迫[36]。本研究中，脯氨酸含量没有上升达到显著水平，可能与脯氨酸受多种代谢途径调控以及田间水分充足有关。 蚜虫在与寄主的相互作用中，会引起寄主植物的形态变化和营养配置的变化， 影响植物的初级代谢，这可能是改善蚜虫生长所需营养物质韧皮部汁液成分的一种策略[37]。

本研究就棉蚜取食棉花后不同组织中的游离氨基酸变化进行了分析，初步揭示了田间棉蚜与寄主棉花的营养关系动态，为寄主植物与昆虫的相互作用提供了新的基础信息。 在今后的深入研究中，可结合田间棉蚜和棉蚜分泌蜜露中的游离氨基酸含量，进一步比较分析寄主植物与昆虫之间的营养需求与相互作用。