个体化叶酸补充对备孕妇女血清叶酸、同型半胱氨酸水平及新生儿结局的影响

张婷睿 余宏杰 陈秋桐 刘明威 何启强,2

[1 武汉大学健康学院，湖北省武汉市 430071，电子邮箱：1184820889@qq.com；2 湖北生物质资源化学与环境生物技术重点实验室(武汉大学)，湖北省武汉市 430071]

叶酸是水溶性B族维生素的一种[1]，参与甲基的传送、体内氨基酸及核酸合成，也是胚胎发育所需的重要营养素，其无法自身合成而依赖于外源性摄取与补充。孕期叶酸的生理需要量明显升高，这导致孕妇成为叶酸缺乏的高危人群[2]。早期母体叶酸摄入不足，会导致孕妇高同型半胱氨酸血症、低出生体重、早产等多种不良母婴结局[3]。而叶酸缺乏症状与叶酸补充不足和叶酸代谢障碍有关[4]，其中引起叶酸代谢障碍的主要因素是叶酸代谢途径中甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)的等位基因发生突变，导致代谢酶活性降低[5]。因此，外源性的叶酸片剂成为妊娠期叶酸缺乏症的主要补充措施。为此，世界卫生组织和许多国家卫生组织不断在制定和完善叶酸补充剂量和强化叶酸饮食的建议。1991～1992年，英国医学研究委员会和匈牙利国家卫生研究所提出，妇女每日补充小剂量叶酸对于降低孕期同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平和对母婴不良结局有一定预防作用[6-7]。2016年，中国营养学会妇幼分会建议妊娠前3个月及整个孕期应补充400 μg/d的叶酸，每日不超过1 mg[8]。本研究依据叶酸代谢MTHFR、MTRR等位基因突变引起的叶酸代谢障碍程度，对适龄备孕妇女进行叶酸利用率风险等级评估，从而进行个体化叶酸补充，观察其血清叶酸、Hcy变化以及胎儿结局，旨在进一步为备孕妇女和妊娠妇女提供更科学、有效的叶酸补充方案和合理补充叶酸的剂量。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2018年7月至2019年8月于荆州某医院门诊或住院部进行孕前检查的1 134例妇女。纳入标准：(1)均为健康适龄备孕妇女，且妊娠后在该院进行产检，无妊娠合并症；(2)无不良孕产史；(3)体质指数在正常范围内，即18.5 kg/m2≤体质指数<23.9 kg/m2。排除标准：(1)患有糖尿病、高血压、甲状腺疾病、恶性疾病或免疫系统疾病等；(2)有吸烟史及饮酒史，或家人有吸烟史；(3)夫妻双方有遗传病史；(4)近期服用过拮抗叶酸和Hcy代谢的药物。本研究已经该院医学伦理委员会批准，入组妇女均自愿参加并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 叶酸代谢障碍遗传检测： 用棉拭子采集妇女口腔黏膜细胞，采用QIAGEN公司DNA提取试剂盒(批号：69504)提取DNA,按试剂盒说明书进行操作。使用TaqMan-MGB探针试剂盒(美国ABI公司)，7900型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点的基因型。TaqMan-MGB探针试剂盒探针检测序列见表1，其包含MTHFR基因rs1801133和rs1801131位点、MTRR基因rs1801394位点的特异性引物(序列见表2)，荧光探针以及TaqManTMUniversal Master Mix等成分。反应体系总体积共10 μL，包括20 ng/μL的DNA模板1 μL、2×TaqManTMUniversal Master Mix 5 μL、上下游引物分别0.2 μL、20×TaqMan-MGB探针0.1 μL、去离子水3.5 μL。反应步骤为95℃ 10 min，92℃ 15 s、60℃ 1 min扩增20个循环，89℃ 15 s、60℃ 90 s扩增30个循环。所有步骤严格按照试剂盒说明书操作。

表1 TaqMan-MGB探针检测探针所在的位置

表2 引物序列

1.2.2 风险评估：利用SDS 2.3分析软件确定各样本的基因分型结果并进行叶酸利用率风险等级评估。根据MTHFR、MTRR等位基因检测结果，进行叶酸利用率风险等级[9]评估，分为未发现风险、低度风险、中度风险和高度风险4个等级。

1.2.3 叶酸补充方案： 未发现风险组和低度风险组推荐孕前3个月和孕期前3个月补服0.4 mg/d剂量的叶酸，中度风险组推荐孕前3个月和整个孕期补服0.4 mg/d剂量的叶酸，高度风险组推荐孕前3个月和整个孕期补服叶酸0.8 mg/d剂量的叶酸。

1.2.4 实验室指标检测：按推荐叶酸剂量按时服用3个月后，采集妇女静脉血5 mL，放入抗凝真空采血管，3 500 r/min离心15 min，取上清液。使用4000PLUS全自动电化学发光免疫分析仪(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司),采用电化学发光法测定血清叶酸,正常参考值范围为7.0～46.4 nmol/L。采用 AU5400全自动快速免疫分析仪(日本Olympus公司)测定血清Hcy，正常参考值范围为5～15 μmol/L。所有实验步骤严格按照说明书操作。

1.2.5 资料收集：收集所有研究对象的临床资料，包括年龄、民族、文化程度、职业。

1.2.6 随访： 为了解个体化叶酸补充对孕妇的血清Hcy水平和妊娠结局的影响，叶酸干预后继续对183名孕妇随访12个月，检测其孕早期血清Hcy水平，记录其分娩时孕周、新生儿出生时体重及出生缺陷情况。其中，早产定义为孕周小于37周出生的活产儿；低出生体重定义为新生儿出生体重<2 500 g；出生缺陷包括先天性心脏病、唐氏综合征、神经管畸形(脊柱裂、无脑等)、唇腭裂等先天性疾病。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 1 134名妇女的叶酸利用率风险等级及人口学特征资料 1 134名备孕妇女中，未发现风险385例，低度风险105例，中度风险387例和高度风险257例。人口学特征资料见表3。

表3 不同叶酸利用率风险等级妇女人口学特征资料

2.2 个体化叶酸补充前后备孕妇女的血清叶酸和Hcy水平变化 通过个体化叶酸补充后，各叶酸利用率风险评估等级备孕妇女的血清叶酸及Hcy水平均能维持在正常范围，且与补充前比较，各风险等级的叶酸水平上升，低度风险、中度风险、高度风险的Hcy水平下降(均P<0.05)，见表5。

表5 不同叶酸利用率风险等级备孕妇女个体化叶酸补充前后血清叶酸和Hcy水平(x±s)

2.3 个体化叶酸补充后备孕妇女血清叶酸与Hcy水平的相关性 个体化叶酸补充后，各风险等级的备孕妇女血清叶酸与Hcy水平均呈负相关(均P<0.05)，见表6。

表6 个体化叶酸补充不同叶酸利用率风险等级备孕妇女血清叶酸与Hcy水平的相关性

2.4 不同叶酸利用率风险等级间产妇孕期血清Hcy水平及妊娠结局 继续随访的183名孕妇叶酸利用率风险评估，未发现风险孕妇49例，低度风险孕妇13例，中度风险孕妇64例和高度风险孕妇57例。所有风险等级孕妇孕早期(12.26±1.21)周血清Hcy水平均在正常范围内，均未出现高Hcy血症；高度风险组有1(1.75%)例早产儿，中度风险组中有1(1.56%)例低体重产儿；均无出生缺陷新生儿。见表7。

表7 不同叶酸利用率风险等级产妇孕早期血清Hcy水平、产期及新生儿出生体重(x±s)

3 讨 论

叶酸多存在于天然蔬菜中，烹饪时容易受热分解，并且不易被人体吸收。天然的叶酸需要通过小肠黏膜的作用被水解为单谷氨酸叶酸后才能被人体吸收[10]。叶酸补充剂通常为蝶酰谷氨酸，是叶酸代谢产物[11]。叶酸缺乏主要可导致典型的巨幼红细胞贫血，引起MTHFR、MTRR基因活化和修复异常，导致抑癌基因失衡，与各种癌症疾病有关[12]。由于营养摄入不均衡或叶酸代谢障碍等原因，妊娠期更容易出现叶酸摄入不足。孕期叶酸缺乏容易出现先兆子痫、胎盘早剥和自发性流产等，同时会导致胎儿宫内发育迟缓、早产和新生儿体重偏低，还会增加胎儿先天性心脏病、唐氏综合征、神经管畸形(脊柱裂、无脑等)、唇腭裂等的发生风险[13]。叶酸的吸收不仅与叶酸代谢酶活性有关，还与种族、民族、饮食习惯和个体差异有关[14]。患有糖尿病、甲状腺疾病以及肥胖症的妊娠妇女，补充应当剂量的叶酸无法达到补充叶酸的效果[15]；而补充高剂量的叶酸，往往会掩盖因维生素B12缺乏而引起的神经性贫血症或直肠癌[16]。因此，通过叶酸代谢障碍遗传检测以判断叶酸的利用能力，从而进行个体化叶酸补充具有重要意义。

本研究依据叶酸利用率风险等级评估，对备孕妇女叶酸代谢情况进行分级，按照风险等级给予叶酸补充的个体化指导意见，结果显示，通过个体化叶酸补充后，各风险等级备孕妇女的血清叶酸水平不仅能维持在正常范围，且较补充前更高(P<0.05)，初步体现了叶酸补充的效果。研究表明,MTHFR和MTRR还原酶等位基因的突变会导致叶酸代谢障碍，造成叶酸代谢紊乱，同时还影响Hcy水平[17];在低叶酸水平的环境下,MTHFR和MTRR还原酶等位基因的突变者血Hcy浓度可显著升高,而高Hcy会引起静脉栓塞,从而导致早产等不良妊娠结局[18]。有研究表明，妊娠期妇女补充叶酸，短期内可使血清叶酸水平升高，可调控蛋氨酸循环通路，降低血清Hcy水平，进而有效地减少妊娠高血压症、糖尿病以及不良妊娠等事件[19]。在本研究中，采用个体化叶酸补充后，随着血清叶酸水平的升高，低度风险、中度风险、高度风险备孕妇女的血清Hcy水平有所下降，相关性分析也进一步证实血清叶酸与Hcy水平呈负相关(P<0.05)；此外，接受随访的备孕妇女孕早期血清Hcy水平均在正常范围内，未出现高Hcy血症。总之，不同叶酸利用率评估风险等级备孕妇女通过个体化的叶酸补充，不仅可提高血清叶酸水平，同时还可降低血清Hcy含量，有效地预防妊娠期高Hcy血症。

低血清叶酸水平、高Hcy血症与不良妊娠结局密切相关，通常会导致胎儿多神经管缺陷、先天性心脏缺陷、低出生体重、早产等多种不良事件[20]。赖毓冕[21]发现，新生儿出生体重受孕期母体血 Hcy 水平影响，孕妇血浆 Hcy 水平升高会显著增加分娩小于胎龄儿的危险。有学者发现，叶酸代谢基因的多态性或缺失与自发性早产有关，摄入叶酸补充剂或食物来源叶酸可以减少早产的发生[22]。李楠等[23]发现，围孕期或孕期补充低剂量叶酸的孕产妇可提高产儿体重。在本研究183例样本的随访中，仅发现早产儿与低出生体重儿各1例，且未发现出生缺陷产儿。这提示个体化叶酸补充对于预防新生儿不良结局有一定的作用。

综上所述，根据叶酸代谢MTHFR、MTRR等位基因突变引起的叶酸代谢障碍程度评估叶酸利用率风险等级，再进行备孕期个体化叶酸补充，可以短期内提高血清叶酸的浓度，并且控制血清Hcy水平，可预防因叶酸缺乏或高Hcy血症而引起的新生儿不良结局。本研究存在一定的局限性：纳入人群区域性较强，个体差异性较大，横断面研究不能确定其因果关系，还应与非个性补充效果相比较等。此外，由于我国国土面积广大，各地饮食习惯的不同，例如南北饮食差异明显，北方饮食中新鲜水果蔬菜摄入较少，叶酸摄入平均水平低于南方，还应细化叶酸补充指导方案，将基因检测和饮食习惯相结合，从遗传因素、饮食方式、运动方式和生活方式等方面，在备孕阶段及孕早、中、晚期推荐个体化的因地制宜的健康饮食指导意见。