染色体微阵列分析在胎儿颅内结构异常产前诊断中的应用

宁舒婷 张海英 耿国兴 王映飞 黄而弘 李敏清

(广西壮族自治区江滨医院 1 妇产科，2 B超科，南宁市 530021，电子邮箱：810104953@qq.com；广西壮族自治区妇幼保健院 3 遗传代谢中心，4 放射科， 南宁市 530002；5 广西医科大学第一附属医院产前诊断与遗传病诊断科，南宁市 530021)

随着我国女性初次生育年龄逐渐增大及二胎政策的全面实施，出生缺陷率呈逐年上升趋势[1]。神经系统畸形是胎儿时期较常见的先天异常，患病率为0.14%～0.16%[2]。神经系统畸形包括颅内结构异常与脊柱结构异常，其中颅内结构异常是神经系统畸形的主要类型，种类较多，包括神经管缺陷(无脑畸形、露脑畸形、脑膨出及脑膜膨出)、脑积水和脑室扩张、胼胝体发育不全、Dandy-Walker综合征、前脑无裂畸形、脉络丛囊肿等。

研究表明，胎儿神经系统结构异常与染色体病(数目异常和结构畸变)关系密切，尤其是18-三体和13-三体[3]。在过去40年里，胎儿神经系统畸形的遗传学产前诊断方法主要是经典的显带核型分析。然而，传统的显带核型分析不能发现小于5 Mb的染色体异常，不能识别染色体微缺失和微重复。Hultén等[4]研究发现，传统的染色体核型分析只能检出15%～40%的染色体异常。在临床中，我们也时常发现传统的染色体核型分析未发现异常的胎儿结构畸形病例，往往隐藏着亚显微基因组拷贝数变异(copy number variation，CNV)，而微缺失和微重复变化常与胎儿发育异常相关。近年来新兴发展的高分辨率染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)，通过对基因组CNV的检测分析，可检出50～100 kb的CNV，并能识别常规染色体核型分析不能发现的微缺失或微重复，额外发现6%～15%的染色体细微变异，对染色体亚微结构异常进行诊断，突破了传统核型分析的技术局限性。此外，CMA无须组织或细胞培养，可避免母体污染，检测所需时间短，是分子细胞遗传学技术的革命性发展[5]。CMA检测能显著提升染色体疾病检出能力[5-8]，实现产前诊断的精确化，在以胎儿超声异常为主的产前诊断中有着重要的临床意义。目前，CMA单独应用于胎儿颅内结构异常诊断的大数据研究罕见报告。因此，本研究对121例超声诊断存在胎儿颅内结构异常的病例进行回顾性分析，比较其染色体核型分析及CMA的检测结果，探讨产前CMA在胎儿颅内结构异常产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月至2018年7月在广西壮族自治区妇幼保健院产科门诊或优生遗传科就诊的121例胎儿颅内结构异常病例，回顾性分析其临床资料。纳入标准：孕期胎儿超声检查发现胎儿颅内结构异常。排除标准：(1)胎儿存在脊柱结构异常；(2)孕妇认知功能障碍；(3)孕妇随访不确定者。孕妇年龄17～44岁，孕周17～34周。

1.2 超声检查方法 使用日本东芝Aplio 400型彩色多普勒超声诊断仪，二维凸阵探头频率为3.5～5.0 MHz。受检孕妇取仰卧位，超声检查切面包括:丘脑、侧脑室、小脑切面，脊柱纵切面，鼻骨矢状正中切面，眶间距切面，颜面冠状切面，四腔心、左右心室流出道观、三血管观，主动脉弓切面、导管弓切面，腹围切面，膀胱旁脐动脉切面，双肾横切面及纵切面，双上肢肱骨、尺桡骨、双下肢股骨、胫腓骨纵切面等。同时观察羊水、脐带及胎盘情况。

1.3 G显带核型分析及CMA检测方法

1.3.1 取材：孕妇充分知情并签署同意书，经排除手术禁忌证后获取胎儿细胞。其中，孕17～22周孕妇选择经腹羊膜腔穿刺术获取羊水，孕周>22周者选择经皮脐静脉穿刺术获取脐血标本。获取的标本均分为两份。

1.3.2 染色体核型分析方法：取其中一份标本制备染色体。其中羊水标本以1 500 r/min离心8 min，弃上清液。因双人双线培养，沉淀物被分为2份，同时接种于美国Irvine Scientific公司和广州白云山拜迪生物医药公司生产的两种羊水细胞培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养7～10 d；在Olympus CKX31倒置显微镜(日本Olympus 公司)下观察细胞生长情况，待细胞贴壁并生长至7～8个较大克隆时，加秋水仙素终止细胞与分裂中期，采用胰酶消化法收获培养的羊水细胞，1 800r/min离心8 min收获细胞沉淀。脐血标本送实验室后，也需双人双线培养，标本分别接种于广州达晖生物医药公司和广州白云山拜迪生物医药公司生产的2种淋巴细胞培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养68～72 h后，加秋水仙素终止细胞于分裂中期，1 800 r/min离心8 min收获脐带血细胞沉淀。对羊水或脐带血细胞沉淀依次行固定3次[用0.075%氯化钾、3 ∶1(甲醇 ∶乙酸)的固定剂]、滴片、显带、染色，然后采用G显带核型分析技术，均采用德国蔡司染色体分析软件进行核型分析，常规计数20个核分裂象，分析其中5个核型。若发现异常嵌合体核型，则将计数与分析增加至50个核分裂象。根据2013版《人类细胞遗传学国际命名体制》(ISCN2013)[9]，对检出的染色体核型进行命名。

1.3.3 CMA方法：取另一份标本，采用厦门致善生物科技有限公司生产的Lab-Aid 820核酸提取Midi试剂盒(批号：200116)，按试剂盒说明书进行DNA提取，DNA质检操作标准根据Human Cyto SNP-12 300K微阵列芯片(美国Illumina公司)操作手册执行。检测流程包括DNA定量，全基因组扩增，DNA片段化，沉淀、重悬DNA片段，DNA与芯片杂交，芯片清洗，单碱基延伸及染色，包被芯片。用Illumina iScan激光共聚焦扫描仪对杂交后的芯片进行扫描，数据结果使用KaryoStudioV1.4.3.0软件进行分析。查阅常用数据库[Clingene(https：//www.clinicalgenome.org)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、DECIPHER(https：//decipher.sanger.ac.uk)、DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)和OMIM(http：//omim.org)等]及PubMed数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，对检出异常CNV及嵌合情况进行分析。CNV的致病性按美国医学遗传学与基因组学学会制定的相关致病性判读指南[10]进行判读。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 121例颅内结构异常胎儿的染色体核型分析结果 121例颅内结构异常的胎儿中，核型正常 110例，占90.9%；染色体核型异常11例，检出率为9.1%，其中致病性染色体异常(非整倍体异常、非平衡性结构异常核型)7例(5.8%)。在11例染色体核型异常的病例中，染色体数目异常共 4例(21-三体综合征1例、18-三体综合征1例、胎儿标记染色体1例、9号染色体短臂四体并性染色体嵌合异常1例)，染色体结构异常共7例(平衡易位1例、臂间倒位2例、大片段缺失2例、大片段重复2 例)，见表1。

表1 11例染色体异常胎儿的颅内结构异常表现、CMA结果及临床结局

2.2 颅内结构异常胎儿的CMA结果 121例胎儿中，26例检出CNV，检出率为21.5%，其中致病性CNV共15例，检出率为 12.4%，意义不明确的变异(variants of unknown significance，VOUS)共 11例，检出率为9.1%。CMA对致病性CNV的检出率(12.4%)与染色体核型分析的致病性染色体检出率(5.8%)比较，差异无统计学意义(χ2=2.450，P=0.118)，但针对致病性染色体异常，CMA较传统的核型分析额外增加了6.6%的检出率。

15例致病性CNV中，非整倍体染色体异常3例，均与染色体核型G显带结果一致；染色体大片段缺失1例，染色体核型分析提示46，XN,del(5)(p14)；部分缺失部分重复1例，染色体核型分析提示46，XN,del(18)(q22q23)；染色体大片段重复2例，染色体核型分析分别为46，XX,der(2)t(2;7)(q37;q22)和46，XN，der(7)t(2；7)(p23；q35)；微缺失微重复8例，染色体核型分析均正常。见表2。

表2 15例致病性CNV胎儿的CMA及染色体核型检测结果、颅内结构异常表现、临床结局

15例致病性CNV中，7例为明确的微缺失/微重复综合征及致病性综合征，分别是猫叫综合征、16p13.11微缺失综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Smith-Magenis综合征、21-三体综合征、18-三体综合征,1q21.1微缺失综合征;其余8例所包含的致病性 CNV，在DECIPHER 数据库中已有较多变异报告，并存在临床表型及导致神经系统畸形的致病基因。15例致病性CNV经随访，均通过引产终止妊娠。

3 讨 论

染色体亚显微层面结构异常引发的出生缺陷，临床表型的严重性不亚于染色体显微层面上数目或者结构异常，而CMA技术的革命性发展，为检测这种亚显微染色体异常提供了一种新方法。Wapner等[5]研究发现，应用CMA 进行检测可以较常规核型分析多发现6%的病理意义拷贝。 Sun等[11]对46例胎儿神经系统发育异常但染色体核型分析正常的孕妇进一步行 CMA检测，发现在37.0%的病例中检测到 CNV，10.9%的胎儿有致病性 CNV。此外，有研究表明，在染色体核型分析判定为平衡易位样本中，有7.9%的样本在断裂连接处存在CNV[12]。因此，应用 CMA 技术可同时了解遗传物质数量是否发生增减，为胎儿去留的选择提供重要依据[12]。

本研究中，采用CMA共检出致病性CNV 15例(检出率为12.4%)，其中7例为明确的微缺失/微重复综合征及致病性综合征，8例所包含的致病性 CNV存在临床表型及导致神经系统畸形的致病基因，经随访均通过引产终止妊娠。而染色体核型分析检出核型异常11例(检出率为9.1%)，其中致病性染色体异常(非整倍体异常、非平衡性结构异常核型)仅7例(5.8%)。虽然两种技术的致病性染色体异常检出率差异无统计学意义(P>0.05)，但针对致病性染色体异常，CMA仍较传统的染色体核型分析额外增加了6.6%的检出率，CMA检出的8例微缺失/微重复，其染色体核型分析均正常。额外发现的这8例致病性CNV，如果只进行传统的核型分析，有可能会因为所谓的“金标准”无异常选择继续妊娠，在后续的检查发现更严重的异常而影响临床干预时机。由此可见，针对影像学检查提示胎儿颅内结构异常的孕妇，即使传统核型分析提示结果正常，行CMA分析也是必要的，其可为评估胎儿预后提供更多信息，有利于遗传咨询及再发风险的评估，并可进一步减少活产儿严重出生缺陷的发生。此外，在本研究的11例提示染色体异常的胎儿中，有1例胎儿标记染色体CMA未检出异常，随访时孕妇拒接电话，胎儿结局失访，3例为平衡易位的胎儿CMA 结果均未见异常，随访均正常分娩，婴儿生长发育正常。由此可见，染色体核型异常的胎儿，由于遗传物质数量未发生增减，微阵列芯片结果可正常，这对于胎儿去留的选择有着重要的参考意义。然而，微阵列技术也存在局限性，其不能检测出拷贝数没有变化的染色体异常，如染色体平衡性结构改变(相互易位、倒位、插入)，而此类染色体物质的平衡与重排对目前妊娠虽没有影响，却与未来的生殖咨询有关。

总之，对存在颅内结构异常的胎儿，CMA较传统核型分析可提供更多临床信息，对胎儿结局的评估有着重要意义。故当产前检查发现胎儿颅内结构异常时，应产前同时行染色体核型分析及CMA分析。