注射用曲札茋苷对呼吸系统疾病作用的实验研究

赵水仙 杨旭娟 杨晓芸 黄 茜 黄 青 孟 珂 翁雨天 李 霞 刘一丹*

1.大理大学，云南 大理 671000；2.昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650100； 3.云南中医药大学，云南 昆明 650500；4.昆明医科大学，云南 昆明 650500

曲札茋苷是从植物拉萨大黄根茎中提取出来的一种化合物，分子式C20H22O9，属于羟基二苯乙烯类化合物，具有较强的生物活性，具有抗凝血、清除氧自由基、抑制血小板聚集、较强的抗氧化性、保护脑组织、抑制炎症反应和神经细胞凋亡从而阻断对脑组织的损伤作用[1-2]。注射用曲札茋苷为昆药集团股份有限公司自主研发的创新药物，主要用于治疗急性缺血性脑卒中，然而对注射用曲札茋苷用于其他新适应症的报道鲜有，例如对呼吸系统性疾病的作用尚无报道。

咳嗽、哮喘是呼吸系统中最常见的两种疾病，一般情况下，咳嗽是一种重要的防御机制，通过清除咽部、呼吸道分泌异物从而防止感染形成，但是频繁剧烈的咳嗽可能引起多个系统的并发症，给患者造成极大痛苦，严重影响患者的工作、生活和社会活动，咳嗽的治疗在全球的范围内受到高度重视。哮喘是临床上的常见多发病，严重威胁着公众健康和生命安全，根据世界卫生组织统计，哮喘患病人群基数大，患病人口数逐年上升，而我国哮喘药物主要依赖进口药[3-4]，因此，研发镇咳、平喘药物具有十分重要的意义。

笔者通过浓氨水致小鼠咳嗽法、酚红排泌法、(Lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性肺损伤、豚鼠磷酸组胺和氯化乙酰胆碱引喘法，观察曲札茋苷有无镇咳、祛痰、平喘及对急性肺损伤的保护作用实验研究，揭示曲札茋苷在镇咳、祛痰、平喘及治疗急性肺损伤上的效果，以期为今后曲札茋苷新适应症的开发提供参考依据，为研究防治或改善呼吸系统疾病的创新药物提供实验基础。

1 实验材料

1.1 药物、试剂与仪器

1.1.1 药物和试剂 注射用曲札茋苷(昆药集团股份有限公司，批号：20190822-2)；苯酚红(天津市光复精细化工研究所，批号：121220)；碳酸氢钠(天津市光复科技发展有限公司，批号：140816)；氨溴索(昆药集团股份有限公司，171012-1)；脂多糖(LPS)(sigma,批号：L-2880)；盐酸地塞米松(国药集团容生制药有限公司，批号：1904206)；磷酸可待因(青海制药厂有限公司，国药准字号：H63020055 )；氨茶碱(昆药集团股份有限公司，国药准字号：H53021194)；磷酸组胺(中国食品药品检定研究院，批号：150510-201313)；生理盐水(浙江国镜药业有限公司，批号：A170525 A1)；水合氯醛(山东西亚化学工业有限公司，批号：119957)。

1.1.2 仪器 电子分析天平(Mettler Toledo)；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司 DHG-9245A)；酶标仪(美国Bio-Tek powerwave)；离心机(effendorf)；超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司 402AI)。

1.2 实验动物 SPF级雄性美国癌症研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠，体重23～25g，由昆药集团动物室提供，生产许可证：SCXK(滇)K2014-0001；使用许可证：SYXK(滇)K2014-0001；发证机关：昆明市科学技术局。豚鼠，雌雄兼备，昆明楚商科技有限公司。

2 实验方法

2.1 浓氨水镇咳实验[5]ICR小鼠50只，雄鼠，按体重随机分为5组，每组10只：空白对照组、阳性对照组磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg)；除磷酸可待因仅实验当日灌胃给药1次外，其余各组均预先每日腹腔注射1次，连续3d，空白对照组注射等容量的0.9 %氯化钠溶液，各组给药容积均为20 mL/(kg·bw)。末次给药后30 min,将小鼠逐一放入蒸发皿中，用250 mL烧杯反扣于上，同时向蒸发皿中迅速推入25% 浓氨水0.04 mL。以注入浓氨水至第一次张口咳嗽的时间为动物咳嗽的潜伏期，观察并记录各鼠的咳嗽潜伏期及90 s内小鼠的咳嗽次数。为消除系统误差，实验采用平行操作。

2.2 磷酸组胺和氯化乙酰胆碱致豚鼠哮喘实验[6]豚鼠，雌雄兼备，于实验前一天用0.1 %磷酸组胺和1 %氯化乙酰胆碱以1∶1混合，按每只豚鼠喷雾5 mL对其进行筛选，以45秒内出现呼吸困难或抽搐者为合格。哮喘反应分为四级: Ⅰ级-呼吸加速；Ⅱ级-呼吸困难；Ⅲ级-抽搐；Ⅳ级-跌倒，2 min内未出现II-IV级症状者不予选用。

次日将合格豚鼠按性别和体重随机分为5组，每组10只：空白对照组、阳性对照组磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高剂量组(1.25、2.5、5 mg/kg)。除磷酸可待因仅实验当日灌胃给药1次外，其余各组动物每日按剂量腹腔注射给药1次，连续3d，空白对照组注射等容量的0.9 %氯化钠溶液，容积为2 mL/(kg·bw)。末次给药后30 min，将豚鼠逐一放入玻璃干燥器内，打开超声雾化器喷雾45 s，记录开始喷雾至出现II-IV级症状的时间为哮喘潜伏期，若6 min内无上述症状则计为360 s。为消除系统误差，实验采用平行操作。

2.3 酚红排泌实验[7]

2.3.1 酚红标准曲线的制备 精密称取苯酚红适量于容量瓶中，加入5 %的 NaHCO3溶液溶解，配制成100 μg/ mL 苯酚红母液，吸取适量母液，分别稀释成含苯酚红0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5 、10 μg /mL 浓度的标准溶液，以5 %的 NaHCO3溶液作空白调零，于 546 nm波长处测定吸光度值，以苯酚红浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.2 小鼠气管酚红排泌量测定 ICR小鼠50只，雄鼠，按体重随机分为5组，每组10只：模型组、阳性对照组(氨溴索，15 mg/kg )、注射用曲札茋苷低、中、高剂量组(2.5、5、10 mg/kg)。各组动物每日按剂量尾静脉注射给药1次，连续 3 d，末次给药前 12 h 禁食不禁水，于末次给药后1 h，各组小鼠均腹腔注射5 % 酚红溶液20 mL/kg.bw；注射30 min 后，处死动物，剥离气管组织，剪下小鼠自甲状软骨至气管分支处的一段气管，放入预先盛有3 mL 的5 % 碳酸氢钠溶液的试管内，振摇混匀后，置于离心机中离心(2000 r /min) 5min ，取上清液，于546 nm 处测定吸光度值，并按公式计算酚红排泌量(μg/mL)。为消除系统误差，实验采用平行操作。

2.4 LPS致急性肺损伤实验[8-10]ICR小鼠60只，雄性，按体重随机分为6组，每组10只：空白组、模型组、阳性对照组地塞米松(10 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg)；于试验当天造模(LPS：按5 mg/mL，30 μL/只剂量，采用气管滴入法推入)，空白组给予同等的手术刺激。造模后1 h，按剂量尾静脉注射给药1次，连续5d，空白、模型组均给予同体积的0.9 %氯化钠溶液。

2.4.1 肺指数、肺含水量测定 末次给药后1 h处死小鼠，开胸取肺，用吸水纸吸干表面的血液和水分，用电子天平称量全肺湿重(wet weight，W)，以全肺湿重与动物体重的重量百分比为肺指数(lung index，LI)，于恒温干燥箱80℃干燥24 h后，称量肺干重(dry weight，D)，以(肺湿重-肺干重) / 湿重比值(W- D) / W为肺含水量。

3 结果

3.1 注射用曲札茋苷对浓氨水致咳嗽模型小鼠镇咳作用的影响 与模型组比较，注射用曲札茋苷低剂量组和阳性对照磷酸可待因组均能明显减少小鼠对浓氨水致咳嗽的咳嗽次数(P<0.05)。注射用曲札茋苷中剂量和高剂量组也可减少咳嗽次数，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 注射用曲札茋苷对浓氨水致咳嗽模型小鼠镇咳作用的影响

3.2 注射用曲札茋苷磷酸组胺和氯化乙酰胆碱致豚鼠哮喘实验 与模型组比较，曲札茋苷低剂量组能显著延长豚鼠哮喘潜伏期，差异具有统计学意义(P<0.05)。其余各组均具有延长潜伏期的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别给药途径动物数/只剂量哮喘潜伏期/s模型组腹腔注射9-81.22±14.71阳性对照组(氨茶碱)灌胃1040 mg/kg139.30±79.77∗注射用曲札茋苷低剂量组腹腔注射101.25 mg/kg133.90±72.01∗注射用曲札茋苷中剂量组腹腔注射102.5 mg/kg100.3±42.36注射用曲札茋苷高剂量组腹腔注射105 mg/kg93.9±42.29

3.3 注射用曲札茋苷对苯酚红排泌模型小鼠祛痰作用的影响

3.3.1 苯酚红标准曲线 以5 %的碳酸氢钠溶液作为空白对照调零，在可见分光光度计上 546 nm波长测定吸光度值，以吸光度值对溶液中酚红的浓度作回归，制作标准曲线Y= 0.1059X+ 0.0504 ，R= 0.999其中Y为吸光度值，X为酚红溶液的浓度(单位: μg/mL )。结果如图1所示。

图1 苯酚红标准曲线

3.3.2 注射用曲札茋苷对苯酚红排泌模型小鼠祛痰作用的影响 与模型组比较，阳性对照组(氨溴索)能够显著增加小鼠气管酚红排泌量(P<0.05)；注射用曲札茋苷低、中剂量组均能显著增加小鼠气管酚红排泌量(P<0.01)。见表3。

组别给药途径动物数/只剂量酚红排泌量/ μg/mL 模型组静脉注射9-1.516±0.450阳性对照组(氨溴索)静脉注射1015 mg/kg2.120±0.649∗注射用曲札茋苷低剂量组静脉注射102.5 mg/kg2.167±0.512∗∗注射用曲札茋苷中剂量组静脉注射95 mg/kg2.081±0.381∗∗注射用曲札茋苷高剂量组静脉注射1010 mg/kg1.690±0.492

3.4 注射用曲札茋苷对LPS致急性肺损伤模型小鼠肺水肿的保护作用 空白组与模型组比较肺系数差异具有高度统计学意义(P<0.01)，说明LPS致小鼠急性肺损伤模型造模成功，与模型组比较，注射用曲札茋苷低剂量组和阳性对照组均能降低LPS诱导小鼠急性肺损伤后的肺指数(LI)和肺含水量(W- D)/W(P<0.05)。见表4。

组别剂量LI(W- D) / W空白组-0.8188±0.0508∗∗0.7787±0.0048∗∗模型组-1.8259±0.54480.7997±0.0093阳性对照组(地塞米松)10 mg/kg1.2747±0.1821∗0.7840±0.0047∗∗注射用曲札茋苷低剂量组5 mg/kg1.3751±0.4302∗ 0.7913±0.0075∗注射用曲札茋苷中剂量组10 mg/kg1.6911±0.45940.7948±0.0070注射用曲札茋苷高剂量组20 mg/kg1.6191±0.27650.7951±0.0078

4 讨论

小鼠浓氨水镇咳、酚红排泌法是一种用于筛选镇咳祛痰药物可靠的实验方法。对药物的镇咳效果进行评价可分为：机械刺激法、化学刺激法和抗原致敏引咳法[11]，本研究采用小鼠浓氨水引咳的化学刺激，观察刺激后90 s内小鼠的咳嗽次数，有镇咳作用的药物会明显减少咳嗽次数；痰液是由肺泡、支气管、气管分泌，是引起咳嗽的一个重要因素，当痰液排泌量增多时可减少呼吸道黏膜的刺激，从而起到止咳作用，通过测定气管段中酚红排泌量可以判断出药物的祛痰效果，有祛痰作用的药物能够促进酚红排泌量。本研究结果显示，给于小鼠注射用曲札茋苷后，其明显减少小鼠90 s内的咳嗽次数，增加酚红排泌量，提示曲札茋苷可以减少呼吸道黏膜的刺激，达到镇咳效果。

支气管哮喘是一种慢性炎症性疾病，以气道高反应和可逆性气道阻塞为主要体重，气道的慢性非特异性炎症是哮喘发病的病理学基础，是导致气道高反应支气管痉挛的主要原因[12]。目前临床上应用最多的非特异性气道激发实验为吸入组胺和乙酰胆碱。在体研究显示，曲札茋苷低剂量组能够显著地延长豚鼠哮喘潜伏期，表明注射用曲札茋苷有明显的平喘作用，而它的平喘机制可能与松弛气管平滑肌有关。

急性肺损伤(ALI)的发生发展十分复杂,肺损伤的保护作用机制涉及多方面因素。近年来，大量研究表明，急性肺损伤的本质发病机制是肺内失控性炎症反应、机体抗炎、促炎系统的失衡。抑制和阻断ALI发生时肺内的炎症反应，改善肺泡-毛细血管膜的通透性是当前ALI治疗的主要着眼点之一。其死亡率高达40%～60%[13]，目前ALI药物治疗方面没有特效药物。曲札茋苷是从天然药物中发现的活性成分，研究发现该成分在体内有抗炎、抗血小板及降低血液粘度作用，并具有明确的肺靶向。本研究结果显示，给于小鼠注射用曲札茋苷后，低剂量组能降低LPS诱导小鼠急性肺损伤后的肺指数和肺含水量，说明曲札茋苷可能是通过抑制和阻断ALI发生时肺内的炎症反应，从而达到对肺损伤的保护作用。

综上所述，注射用曲札茋苷具有镇咳、祛痰、平喘及急性肺损伤保护作用，对于治疗呼吸系统性疾病具有一定的临床意义和参考价值。本研究仅从注射用曲札茋苷的药效学方面探索其镇咳、祛痰、平喘、急性肺损伤保护的作用，对其机制的探索还有待进一步研究。