黄蒲通窍胶囊对VaD大鼠海马CA1区突触超微结构的影响

王 艳，谢道俊，储丹晨，韦 彪，孙愘叡，丁伟军，鲍婷婷，王秋烨，赵志勇，王玉娇，鲍远程

（亳州市中医院，安徽 亳州 236800）

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是指由于脑血管疾病所导致的认知损害，VaD发病机制一般认为是脑血管病的病灶涉及额叶、颞叶及边缘系统，或病灶损害了足够容量的脑组织，导致记忆、注意、执行功能和语言等高级认知功能的严重受损［1］。VaD的神经生化机制分类繁多，机制复杂，主要有胆碱能通路受损、突触损伤、淀粉样蛋白沉积、内皮素-1和降钙素代谢紊乱、兴奋性氨基酸受体激活所导致的细胞损伤、单胺类递质代谢紊乱等，此外还与炎症、自身免疫、遗传等相关。脑源性神经生长因子（brain-derived neurotropic factors，BDNF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及突触可塑性的改变与脑组织损伤后的修复有关，其中突触可塑性的损伤与血管性痴呆发病的相关性越来越引起国内外学者的关注［2-3］。本研究采用永久性结扎双侧颈总动脉的方法制作血管性痴呆大鼠模型，观察黄蒲通窍胶囊对VaD大鼠海马CA1区突触超微结构的影响，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级雄性健康Wistar大鼠，体质量200～230 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，月龄8周，适应性喂养2周。

1.2 试药 多奈哌齐［国药准字H20050978，卫材（中国）药业有限公司生产］；黄蒲通窍胶囊由安徽中医药大学第一附属医院药剂科提供（皖药制字Z20080006，批号20120618）。

1.3 仪器 JEM-1230型透射电子显微镜镜（JEOL日本产）。

2 实验方法

2.1 模型制备 采用永久性结扎双侧颈总动脉（bi⁃lateral cervical vessels occlusion，2-VO）［4］的 方 法 制作血管性痴呆大鼠模型。大鼠术前12 h禁食，自由饮水，用3.5%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于自制的大鼠手术操作木板上，颈部皮肤剪毛备皮，碘伏常规消毒，酒精棉球脱碘。切口位于颈正中线处，长约1 cm，钝性分离皮下组织后，于切口正下方的斜方肌与气管夹角处可见左侧颈总动脉搏动，分离出左侧颈总动脉后，以4号丝线远近端双重结扎，从中剪断，然后右侧操作同左侧。术中动作轻柔，避免钳夹和过分牵拉迷走神经，注意无菌原则，行逐层间断缝合，术后放入保温的鼠笼（电热毯保温），待大鼠清醒后，放回动物笼架上单笼饲养，予自由进食进水，术后每天以碘酒消毒伤口及周围皮肤，连续5 d。假手术对照组：双侧颈总动脉不结扎，余同模型组。

2.2 实验分组与处理 将大鼠适应性喂养2周后进行分组，用计算机随机发生器随机分为5组，即血管性痴呆模型组（简称“模型组”）22只、多奈哌齐+模型组（简称“多奈哌齐组”）22只、黄蒲通窍胶囊中剂量+模型组（简称“黄蒲通窍组”）22只、假手术组12只、正常对照组12只。各组大鼠术后24 h给予相应灌胃，正常对照组、假手术组及模型组给予生理盐水灌胃，剂量为5.0 ml/（kg·d）；多奈哌齐组给予多奈哌齐溶液0.63 mg/（kg·d）灌胃，连续45 d；黄蒲通窍胶囊组给予黄蒲通窍溶液1.51 g/（kg·d），连续灌胃45 d。末次用药24 h后将大鼠断头取脑，进行免疫组化及突触超微结构观察。

2.3 突触超微结构观察 用日产JEM-1230型透射观察摄片，并选择有意义的拍片保存，以Image-Pro⁃Plus 6.0图像分析软件对突触界面参数进行分析。突触界面率的测量参照JONES等［5］方法，即界面曲率=突触界面弧长a/弦长b。突触活性带长度与突触后膜致密物（post synaptic density，PSD）厚度参照GULDNER［6］方法进行测量，突触间隙宽度用多点平均法测定。

2.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间变量比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时，两组间比较采用LSD-t（least significant dif⁃ference）检验；方差不齐时，选用 Dunnett’s T3（3）检验。P<0.05时表示有显著性差异，P<0.01时表示有极显著性差异。

3 结果

3.1 各组突触超微结构电镜观察结果 见图1。正常组及假手术组：突触较密集，突触前后膜、突触间隙和突触囊泡清晰可分辨，突触前膜内可见均匀的小泡，突触后膜致密区染色深，物质密度大。模型组：突触结构有融合现象，前后膜模糊，突触后致密带变薄，密度低，突触囊泡不清晰，可见突触间隙变窄，突触活性带较短，神经元水肿，胞体固缩浓染，突起膜有的发生断裂溶解。黄蒲通窍组及多奈哌齐组：神经元突触结构尚完整，突触前成分内的突触小泡可见，突触小泡数量增多，在突触前膜和后膜处均可见深染物质，以突触后膜处更明显，突触后致密物变厚，突触间隙不清晰，结构有融合现象。

图1 各组突触超微结构电镜观察图 （×30 k）

3.2 各组突触超微结构参数比较 见表1。经统计学分析显示，各组突触间隙无明显差异（P>0.05）；与模型组比较，黄蒲通窍组PSD厚度、突触界面曲率和活性带长度均显著增加（P<0.01），与多奈哌齐组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组突触超微结构参数的比较 （±s）

表1 各组突触超微结构参数的比较 （±s）

注：与正常对照组及假手术组比较，①P<0.05，②P<0.01；与模型组比较，③P<0.01

组 别正常对照组假手术组模型组黄蒲通窍胶囊组多奈哌齐组n 12 12 22 22 22活性带长度（nm）359.4±17.25 359.6±15.36 156.5±36.84②385.8±19.54③388.9±22.99③突触界面曲率1.1±0.16 1.0±0.14 0.8±0.15①1.2±0.19③1.2±0.18③突触间隙（nm）23.0±4.50 23.6±6.50 23.9±5.84 24.2±5.46 25.9±3.93 PSD厚度（nm）58.3±14.66 55.2±13.83 34.2±10.41②69.9±9.23③67.9±10.27③

4 讨论

突触（synapse）一词最早由英国神经生理学家谢灵顿（SHERRINGTON）于1897年提出。Synapse原意为“握手”“连接”之意，确切地说突触就是一个特化的接触点，通过这个点，信息从一个神经元传向另一个神经元，或从一个神经元传向一个效应细胞。按信息传递方式的不同，突触分为电突触和化学性突触，化学性突触的信号传递容易受环境因素的影响，其传递效率不固定，这就为突触可塑性奠定了生理学基础。为了适应环境，神经系统回路在整个生命过程中都是可修饰的，称为可塑性（plasticity），包括结构和功能两方面的变化，前者包括突触连接的形成与消退、突触活性区数量与面积的改变、突触间隙变化以及各种亚细胞结构的改变等；后者主要表现为突触传递功能的增强或减弱，如短时程和长时程改变，长时程改变包括：长时程增强（long-term po⁃tentiation,LTP）和长时程压抑（long-term depression）；短时程改变包括：突触易化（synaptic facilitation）、突触压抑（synaptic depression）和突触强化（synaptic po⁃tentiation）。其中，突触界面曲率、PSD厚度、活性带长度是反映突触结构可塑性的敏感指标［7-8］。

中医古籍中有关痴呆的专论较少，多归属于“痴呆”“呆病”“呆痴”“呆傻”“健忘”等范畴，其基本病机为髓海不足，神机失用。由阴精气血亏损不足，髓海失充，脑失所养，或气、火、痰、瘀诸邪内阻，上扰清窍所致，病位在脑，与心、肝、脾、肾功能失调密切相关［9］，本病临床病机特点以正虚为主，兼有虚实夹杂，单纯实证较少见，证型有肾虚髓亏、肝肾阴虚、痰蒙清窍、瘀阻清窍、心肝火旺、心脾两虚、气虚血瘀等。近年来，大量的研究表明肾精亏虚、瘀血阻络、痰浊阻窍为多见，且单一证候少见，多是两种以上证候的组合。痰浊蒙窍证、瘀阻脑络证、腑滞浊留证在血管性认知障碍（VCI）患者中出现频率高、程度严重，其可能是VCI发病的危险因素［10-12］。黄蒲通窍胶囊是基于多年临床实践总结出来的治疗血管性痴呆的院内制剂，由石菖蒲、益智仁、制何首乌、川芎、大黄、人参等组方而成，具有益气活血、化痰开窍作用。前期动物实验研究表明，黄蒲通窍胶囊能够上调脑缺血后c-fos表达，下调脑组织核因子-κB（BNF-κB）的表达，产生脑保护和抑制神经细胞凋亡的作用，通过Fas信号通路抑制神经细胞凋亡而起到改善记忆和认知功能的作用，临床试验研究发现该药具有明显改善血管性认知功能障碍患者智能积分（ADAS-cog），并且能够提高血管性痴呆患者的血清生长抑素、精氨酸加压素水平，降低血清中NO、NOS的含量［13-17］。

本研究中，我们观察到模型组大鼠的PSD厚度、突触界面曲率、活性带长度明显小于正常对照组，而黄蒲通窍组PSD厚度、突触界面曲率和活性带长度与模型组比较均显著增加。神经递质主要在神经元胞体或轴突末梢的胞浆内合成，储存在突触前的突触小泡内，当神经冲动抵达神经末梢时，末梢的动作电位和离子转移，Ca2+由膜外进入膜内，一定数量的囊泡膜与突触前膜融合，囊泡内的内容物就释放到突触间隙，与突触后膜上的相应受体结合；发挥作用后，神经递质会在突触间隙内被及时清除，以利于下一轮的突触传递。而突触界面曲率的增加，有利于递质与后膜上的受体充分结合，而活性带长度和PSD是突触兴奋性增高的标志，能使突触的传递效能增加，因为PSD厚度的增加和活性带长度的延长有助于下游信号的传递。而突触间隙的增大，会使递质到达突触后膜的时间延长，增加了递质失活的机会，从而导致神经细胞兴奋性的改变。而本实验中，我们尚未观察到突触间隙的改变。

综上所述，与学习记忆有关的脑区内突触超微结构，可因不同的生理病理状态而发生变化，黄蒲通窍胶囊具有增加突触界面曲率和PSD厚度、延长活性带长度的作用，这些可能是黄蒲通窍胶囊改善VaD大鼠学习记忆的作用机制。