扶芳藤提取液对小鼠肝癌微环境中BMSCs Yap蛋白表达的影响

张 齐，高 月，刘 显，李熠毅

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal⁃stem cells,BMSCs）是一种具有易于体外分离、扩增，多向分化等潜能的非造血干细胞［1-2］。近年，BMSCs已然成为现代众学者热门研究的课题之一，但BMSCs亦可在肿瘤微环境中出现形态及染色体等异常改变，进而发生恶性转化［3］。因此，如何安全、有效地将BMSCs应用于临床治疗与研究（特别是肿瘤）已成为当务之急。扶芳藤Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mazz为卫矛科卫矛属植物，具有抗氧化、提高免疫力及改善血流变等功效［4-5］，笔者欲通过体外模拟小鼠肝癌微环境，并加以扶芳藤提取液进行干预，检测小鼠肝癌微环境中BMSCs Yap蛋白的表达情况，以期观察扶芳藤提取液对小鼠肝癌微环境中BMSCs是否具有保护作用，并探讨肿瘤微环境中BMSCs发生恶性转化的可能机制。

1 实验材料

1.1 细胞 小鼠BMSCs细胞株（广州赛业生物科技有限公司，Catalog Number：MUBMX-01001）；小鼠Hepa1-6肝癌细胞株（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Catalog Number：TCM39）。

1.2 试药 参考文献［6］方法制备扶芳藤提取液：取1 kg扶芳藤，加入10倍量水，置于不锈钢锅内蒸煮1 h后过滤，留取过滤液；药渣加入8倍量水，煮开后文火煎30 min，过滤除渣，合并2次过滤液，浓缩至1 000 ml时，冷却；加入95%食用乙醇，混匀至乙醇浓度为80%，室温静置48 h（前24 h内需搅拌3～5次），过滤除渣，滤液于旋转回收器中回收乙醇至无醇味，将无醇液体加热，浓缩为2.0 g/ml的浓度，4℃保存备用，使用时双蒸水稀释即可。

1.3 主要试剂与仪器 胎牛血清（Wisent公司，086-150）；DMEM/F12培 养 基（Hyclone公 司 ，SH30023）；CCK-8试剂盒（上海碧云天公司，C0038）；ECL超敏发光液（Solarbio,PE0010）；研究级显微镜（日本奥林巴斯，IX81）；酶标仪（美国BIORAD，IMARK）；蛋白核酸凝胶电泳转印系统（BIORAD，Mini Protean Tetra Cell Mini Trans-blot cell）；凝胶成像分析系统（BIO-RAD，ChemiDoc）等。

2 方 法

2.1 细胞培养 小鼠BMSCs、小鼠Hepa1-6细胞培养及共培养体系均使用DMEM/F12完全培养基（含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素双抗），置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，待细胞汇合度约达75%～80%时，以0.25%胰蛋白酶消化，传代或冻存，本实验细胞分别选取第三代细胞作为共培养细胞。

2.2 CCK-8法筛选最适药物浓度［7］按照CCK-8试剂盒说明书，铺板，调整细胞至500个/孔。扶芳藤提取液的实验浓度设置为 100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml，每浓度预设 9 个复孔，分别于24 h、48 h、72 h终止培养，并于450 nm波长下分别测各组细胞OD值。

2.3 共培养法模型建立 采用悬挂式非接触共培养小室-Transwell-3450，取对数生长期的BMSCs细胞，消化、调整浓度为2.5×103个/孔种植于Transwell下室内；同样取对数生长期的Hepa1-6细胞，消化、调整浓度为2.5×104个/孔种植于Transwell上室内，置于5%CO2、37℃饱和湿度孵箱中培养，3天换液1次，共培养7 d。

2.4 实验分组 实验分为对照组（单独培养BMSCs细胞，细胞密度与模型组相同）、模型组（采用Tran⁃swell小室将BMSCs与Hepa1-6细胞共培养）、干预组（以最佳浓度扶芳藤提取液干预共培养模型）。共培养7 d后，收集各组细胞，继续培养、扩增，指标检测。

2.5 Western Bolt检测各组BMSCs Yap蛋白表达变化［8］收集各组BMSCs，提取并检测各组BMSCs细胞总蛋白浓度，经制胶、加样、电泳、转膜、封闭、孵育抗体等步骤，于Bio-Rad凝胶成像系统采集凝胶图像，后期使用Quantity One软件计算各条带的光密度值，以β-actin作为内参照，将目的蛋白条带与内参β-actin条带的比值作为参照结果。

3 结果

3.1 不同浓度扶芳藤提取液对BMSCs、Hepa1-6细胞增殖的影响 见表1、表2。

表1 不同浓度扶芳藤提取液对BMSCs细胞增殖的影响（±s，n=9）

表1 不同浓度扶芳藤提取液对BMSCs细胞增殖的影响（±s，n=9）

注：与模型组比较，①P<0.05

组 别 吸光值48 h 0.293±0.006 0.315±0.006①0.322±0.008①0.296±0.004 0.212±0.009①24 h 0.175±0.017 0.176±0.005 0.174±0.005 0.175±0.008 0.172±0.007 72 h 0.411±0.007 0.453±0.005①0.505±0.003①0.317±0.004①0.251±0.006①模型组100 μg/ml组200 μg/ml组400 μg/ml组800 μg/ml组

表2 不同浓度扶芳藤提取液对Hepa1-6细胞增殖的影响（x±s，n=9）

由表1和表2可知，200 μg/ml扶芳藤提取液对BMSCs增殖有促进作用，且能抑制Hepa1-6细胞增殖。本实验依据可促进BMSCs增殖且可抑制Hepa1-6增殖的最小药物浓度为最佳药物浓度，故选用200 μg/ml扶芳藤提取液作为最佳浓度。

3.2 各组BMSCs Yap蛋白表达变化的比较 见图1及表3。

图1 扶芳藤提取液对各组BMSCs Yap蛋白表达变化的影响

表3 各组BMSCs Yap蛋白表达变化的比较（x±s）

由图1及表3可知，与对照组比较，模型组BMSCs Yap蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，干预组BMSCs Yap蛋白表达相对降低（P<0.05），差异均有统计学意义。

4 讨 论

由于BMSCs具有强大的增殖和多向分化的潜能，曾被称之为组织工程学理想的种子。然而，随着研究的不断深入，BMSCs与肿瘤细胞可通过分泌细胞因子与信号分子等途径相互作用，导致BMSCs形态结构、生长、染色体等发生改变，进而诱导其发生异常转化［9-10］。其原因可能与体内外物理、化学等因素的影响有关，如何避免或减少物理、化学等因素对正常BMSCs的影响，成为了BMSCs应用于临床治疗的一道屏障。

扶芳藤，盛产于我国西南地区，侗族、瑶族、哈尼族等民间多使用，最早记载于《本草拾遗》：“扶芳藤，味苦，小温，无毒，主一切血、一切气、一切冷，去百病……变白不老”。部分药理学证实扶芳藤提取液中含有卫矛醇、黄酮类、儿茶素类等成分，其用途广泛，效果明显［5］。肖艳芬等［11］研究证实扶芳藤提取液可提高免疫抑制小鼠免疫功能；肖健等［12］在建立大鼠脑缺血模型后予以扶芳藤提取液治疗，发现扶芳藤提取物对模型大鼠脑组织具有一定保护作用，且该作用可能与抑制白介素-6表达相关。鉴于扶芳藤提取液已有的药理作用，笔者前期亦通过CCK-8等试验检测出该提取液对肿瘤微环境中BMSCs生长曲线及CCND1/CCNB1蛋白有所改善，但其相关机制研究尚未得知，故本实验开展细胞毒理实验，筛选出其最佳浓度来干预体外模拟肿瘤微环境，检测小鼠肝癌微环境中BMSCs Yap蛋白的表达情况，以期观察该提取物对小鼠肝癌微环境中BMSCs是否具有保护作用，并探讨肿瘤微环境中BMSCs发生恶性转化的可能机制。

本实验通过细胞毒理实验筛选出200 μg/ml扶芳藤提取液作为药物最佳浓度，采用Transwell共培养小室，成功建立小鼠BMSCs与Hepa1-6肝癌细胞的共培养体系，结果发现与对照组比较，模型组BMSCs Yap蛋白表达明显升高；与模型组比较，干预组BMSCs Yap蛋白表达相对减少。Yap蛋白作为Hippo信号通路的主要效应分子，属于癌基因，在其信号通路中起着至关重要的作用。LIAN等［13］认为在胚胎干细胞分化过程中，主要效应分子Yap是失活的，而在非分化的干细胞核内却发现增多的非磷酸化Yap，过度表达的Yap可提高诱导多能干细胞重编程效率，Yap同样可与多种与干细胞相关的转录因子相结合，从而调节干细胞的增殖及分化。本实验中模型组Yap蛋白表达结果与文献［13］结果相似，而干预组BMSCs Yap蛋白表达相对模型组减少，故认为200 μg/ml扶芳藤提取液对肿瘤微环境中BMSCs起到一定保护作用。

综上所述，扶芳藤提取液对小鼠肝癌微环境中BMSCs Yap蛋白表达起到一定的抑制作用，Yap蛋白的表达可能为肿瘤微环境中BMSCs发生恶化的一个关键因素。但扶芳藤提取液引导该抑制作用的具体机制及起到抑制作用的药理成分尚未明了。因此，扶芳藤提取液对于小鼠肝癌微环境中BMSCs的保护作用机制仍需进一步深入研究。