不同产地苦木枝高效液相色谱法指纹图谱和主成分分析

徐滢 刘明颖 廖小菁 李瑶芳 王章伟 胡长玲 刘地发 邓双炳

苦木,为苦木科苦树属植物Picrasma quassioides(D.Don)Benn.,药用部位为干燥茎、枝和叶,性寒,味苦,有清热解毒、祛湿的功效,主要用于风热感冒、咽喉肿痛、湿热泻痢、蛇虫咬伤等症[1]。苦木中的主要化学成分为生物碱类成分,苦味素类成分次之[2]。《中华人民共和国药典》2015年版一部、江西省中药材标准2014年版[3]、湖南省中药材标准2009年版[4]和广东省中药材标准第三册2018年版[5]中苦木质量标准均未收载指纹图谱项,苦木质量研究报道多为单个或若干个生物碱的含量测定研究[6-7],作为可较为全面地表征中药物质基础的关于苦木枝的指纹图谱的研究尚无报道。

根据国家药品监督管理局数据库显示,有147个药品批文,其中包括苦木注射液、复方苦木消炎片、消炎利胆片等10个品种,129家企业使用到苦木药材表明苦木的市场需求量很大。苦木属于野生药材资源,生长周期长,且苦木茎、枝和叶的细胞组成差异较大,导致成分种类和成分含有量差异均较大[8],如何合理有效地利用苦木药材具有重要意义。我国中药制剂的质量参差不齐,不同厂家的同中药制剂、同厂家同中药制剂,甚至同厂家同品种的不同批次之间的中药制剂质量差异都较大,除了因生产工艺差异较大和生产工艺参数不稳定外,影响最大的就是药材的质量,因为不同产地、不同采收期、不同药用部位的药材化学成分的种类和成分含有量差异较大[9]。针对中药制剂质量差异大的现状,有学者提出通过控制药材质量、不同批次药材调配和不同批次提取物勾兑投料等方法[10],以实现不同批次中成药制剂间质量的稳定均一。控制药材质量是实现不同批次药材调配和提取物勾兑投料的前提,本文以10个产地10批苦木枝为研究对象,建立其指纹图谱,通过两种不同的相似度评价方法,采用主成分分析对其质量进行评价,可为苦木的合理利用和质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；电子分析天平XS105DU、ML204T(梅特勒-托利多科技有限公司)；超声清洗器KQ-300DE(昆山市超声仪器有限公司)；数显恒温水浴锅HHS-11-2(上海博迅实业有限公司)。

1.2 软件

中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版,国家药典委员会)；程度相似度评价软件[11](1.0版,清华大学中药现代化中心罗国安教授研究团队自主开发)；SPSS Statistics 21.0软件(IBM)。

1.3 材料

乙腈(HPLC,TEDIA公司),冰醋酸、无水乙醇(均为分析纯,广东光华科技股份有限公司),盐酸(分析纯,西陇化工股份有限公司),水为超纯水 (Mili-Q 自 制)。 1-甲 酸-6-羟 基-β-咔 巴 啉(6-hydroxy-β-carboline-1-carboxylic,20160607)、4,5-二甲氧基铁屎米酮(4,5-dimethoxycanthin-6-one,20170912WS)、 1-甲 酸-β-咔 巴 啉 ( β-carboline-1-carboxylic acid,20171019WS)、3-甲基-铁屎米-5,6-二酮(3-methylcanthin-5,6-dione,20160630)、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮(5-hydroxy-4-methoxylcanthin-6-one,20170901WS)均为自制,经光谱学鉴定结构,质量平衡法检测其含量分别为94.0%、99.7%、98.1%、96.0%、98.8%[12]。10个产地苦木枝样品共10批,由复旦大学胡长玲博士采自各产地(见表1),经中国科学院昆明植物研究所龚洵研究员鉴定为苦木科苦树属植物苦木Picrasma quassioides的枝,于江西青峰药业有限公司留存。

表1 10批苦木枝样品产地

1.4 色谱条件

Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相0.2%冰醋酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～9分钟,15%→18%B；9～12分钟,18%→21%B；12～15分钟,21%→30%B；15～20分钟,30%→36%B；20～25分钟,36%→50%B；25～40分钟,50%→90%B；40～45分钟,90%→15%B)；后运行10分钟；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm,进样量20 μL。

1.5 对照品溶液的制备

精密称取 1-甲酸-6-羟基-β-咔巴啉、4,5-二甲氧基铁屎米酮、1-甲酸-β-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮约10 mg,于100 mL量瓶中,加2%盐酸溶解并稀释至刻度,摇匀,得到对照品溶液贮备液；再精密移取上述溶液1 mL,于25 mL量瓶中,加2%盐酸稀释至刻度,摇匀,即得。

1.6 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入80%乙醇50 mL,超声处理30分钟,放置至室温,摇匀,滤过。将上述滤液置蒸发皿中,水浴蒸干,用2%的盐酸10 mL分三次溶解提取物,并转移至50 mL量瓶中,超声10分钟使之溶解,加2%盐酸稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

1.7 方法学考察

1.7.1 仪器精密度试验 取同一苦木枝(S1),按“1.6”项下方法制备供试品溶液,按“1.4”项下色谱条件连续进样6次,以18号峰为参照峰,测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于2.0%,表明仪器精密度良好。

1.7.2 重复性试验 取同一苦木枝(S1)6份,按“1.6”项下方法平行制备供试品溶液,按“1.4”项下色谱条件分别进样,以18号峰为参照峰,测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3.0%,表明本方法重复性良好。

1.7.3 稳定性试验 取同一苦木枝(S1),按“1.6”项下方法制备供试品溶液,按“1.4”项下色谱条件分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时进样,以18号峰为参照峰,测得共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3.0%,表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2 结果

2.1 苦木枝高效液相色谱法指纹图谱测定

分别取10批不同产地的苦木枝,按“1.6”项下方法平行制备供试品溶液,按“1.4”项下色谱条件分别进样,记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对所得谱图进行处理,共标记24个共有峰,且共有峰占比大于90%。经与对照品溶液保留时间和紫外吸收特征图谱比对,确认样品图谱中3号峰为1-甲酸-6-羟基-B-咔巴啉、6号峰为1-甲酸-B-咔巴啉、8号峰为3-甲基-铁屎米-5,6-二酮、18号峰为4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮、23号峰为4,5-二甲氧基铁屎米酮。4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮为苦木枝主要活性成分,且其峰面积较大,与相邻色谱峰分离度较好,因此选择4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮(18号峰)为参照峰。以S1号色谱图为参照谱图,采用中位数法,时间窗为0.1,多点校正后自动匹配生成对照图谱,见图1～2。

图1 对照指纹图谱

图2 10批苦木枝高效液相色谱法指纹图谱和对照指纹图谱

2.2 相似度评价

将10批苦木枝色谱图导入中药色谱图谱相似度评价系统(2012版),以“2.1”项中生成对照图谱,进行相似度评价,10批样品相似度均大于0.9,说明10个产地整体上一致性较好,但是从谱图上来看20～26分钟这个时间段上各产地在成分的种类和含量上有较大的差别。因此以“2.1”项中生成对照图谱的共有峰面积为对照,将其和10批样品共有峰面积按照保留时间顺序导入程度相似度评价系统(1.0版)中,得到各批次的程度相似度。

结果显示,10批样品相似度大于0.9,程度相似度大于0.7,表明10个产地的苦木枝化学成分一致性较好。广东英德、广西河池、广西梧州、贵州都匀和江西赣州的两种相似度值较其余5个产地的高,表明该5批相似度较高,对对照图谱贡献率较高。结果见表2。

2.3 主成分分析

主成分分析是较为常用的多指标、多变量降维的分析方法,可用于中药材综合质量的评价。为了更好地评价样品,将10批苦木枝共有峰峰面积通过SPSS Statistics 21.0软件标准化描述后,通过降维中的因子分析,计算相关系数矩阵、主成分特征值、累计贡献率和主成分综合得分等,结果见表3、表4、图3和图4。

表2 10批苦木枝相似度结果

表3 特征值和方差贡献率

以特征值大于1为提取标准,得到前2个主成分的累计贡献率为92.358%,代表苦木枝中24个成分量92.358%的信息量,具有很好的代表性,可代表苦木枝的质量。从表4可以得出,第1主成分信息主要来源于色谱峰 2、3、6、8、9、12、16 ～18、20、24,其中色谱峰3、8、18影响较大,分别为1-甲酸-6-羟基-B-咔巴啉、3-甲基-铁屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮,均为苦木的活性成分,其中4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮为其主要活性成分；第2类主成分信息来源于色谱峰 1、7、10、11、23；第 3 类主成分信息来源于色谱峰13。根据各主成分载荷向量除以各主成分特征值的算术平方根计算得到各批次的综合得分。主成分分析结果显示,广东英德、广西河池、广西梧州、贵州都匀和江西赣州的5批苦木枝成分含有量较其余5批的高,其中S2综合得分最好,质量最好。综合得分结果,程度相似度、相似度结果一致,表明主成分分析可以更加直观的评价苦木枝的质量,与两种相似度的结果形成互补。结果见表5。

表4 初始因子载荷矩阵

图3 公共因子碎石图

图4 样品在3个主成分的平面分布图

表5 主成分得分和综合得分

3 讨论

中药制剂和中药材为多组分复杂体系,中药材质量的稳定可靠是中药制剂质量稳定可靠的前提保障,中药指纹图谱[13]是建立在中药化学成分系统研究的基础上,对中药化学成分物质基础的一种整体表达方式,能较好地体现中药材的复杂性和整体性,是一种有效的中药材质量分析手段。目前笔者未见对苦木枝高效液相色谱法指纹图谱的报道,本文首先通过对提取方式、提取溶剂、提取时间、溶剂倍数、检测波长、流动相、色谱柱等进行考察,综合得到获得苦木枝高效液相色谱法指纹图谱的最佳提取方法和最佳色谱条件。

随着化学计量学在药学方面的不断应用,不少学者通过对中药指纹图谱进行主成分分析研究[14-15],可以更好地分析指纹图谱的数据,从而更加直观地表征中药的特征。本文通过相似度评价、程度相似度评价和主成分分析3种方式,对不同产地的苦木枝的24个共有峰进行分析,结果表明10个产地的苦木枝化学成分均一性较好,但是作为主产地的广东和广西的成分含有量较高,综合得分也较高,其中S2得分最高、质量最好。表明地理位置和生长环境对药材化学成分有一定的影响,地理位置较为接近的,化学成分较为一致,相似度较高,一定程度上证明道地药材的重要性。本文通过指纹图谱和主成分分析对不同产地苦木枝进行质量评价,可以更加直观地评价苦木枝的质量,可为苦木枝的质量控制及其制剂的投料提供参考依据。