补肾活血方对兔NPMSCs移植治疗退变椎间盘P38MAPK信号通路的影响

刘奕 陈晓峰 刘逸 蔡东岭

腰痛,作为临床常见病、多发病之一,据资料显示,约80%人群存在不同程度腰腿疼痛症状,可影响患者日常生活及工作,对患者生活质量造成严重影响[1]；其病理改变的前提及基础为腰椎间盘退变。腰椎间盘退变,引起脊柱生物力学改变,随着细胞外基质降解和椎间盘高度降低,髓核突出对脊神经根或脊髓进行压迫,最终导致神经不可逆损伤[2]。P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)是细胞内的一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的一类重要信号系统,目前研究发现P38MAPK信号转导途径在椎间盘退变过程中可能处于枢纽地位,对炎症、应激反应的调控密切相关,其中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)的表达在椎间盘退变组织中表达明显增加[3]。但是,腰椎间盘退变是一个非常复杂的过程,如何使退变椎间盘再生修复成为生物学上研究的热点,也是临床治疗上的难点。本研究在中医学思想指导下,发挥中医特色,采用补肾活血方对兔髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells,NPMSCs)移植治疗退变椎间盘,旨在探索补肾活血方联合NPMSCs移植对P38MAPK信号通路的影响,为临床诊治退变椎间盘提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

128只SPF级健康新西兰大白兔,雌雄不限,兔龄6～12月,体重(2.54±0.28)kg,购自广东省医学实验动物中心,生产许可证号：SCXK粤2019-0002。在室温、安静环境下单笼饲养,模拟昼夜光12小时轮换,供应足量的食物和水。其中2只用于NPMSCs的获取、纯化及培养,24只用于假手术组(A组)；余102只兔退变椎间盘模型造模过程中死亡2只,成功造模100只,随机选取48只为模型组(B组,24只)、补肾活血方组(C组,24只)；最后52只经NPMSCs移植后死亡4只,余48只随机分为NPMSCs移植组(D组,24只)、补肾活血方+NPMSCs移植组(E组,24只)。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人单克隆抗体 P38MAPK、MMP-3、MMP-7免疫组化试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司。组织脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烘片机、显微镜均为广东省医学实验动物中心提供。

1.3 NPMSCs的获取、纯化及培养

取2只健康成年新西兰大白兔,采用空气栓塞法处死,在无菌条件下取其肱骨、股骨、胫骨,将其放入超净台中,用无菌剪将骨骼从中间剪断,然后用装有5 mL的DMEM培养基的注射器针头插入骨髓腔,反复冲洗,收集骨髓混合液。然后依次将骨髓混悬液离心、培养,并用倒置显微镜观察NPMSCs的形态及贴壁及生长情况。具体操作参考文献[4]。

1.4 补肾活血方浸膏的制备

补肾活血方由11味药物组成：骨碎补、补骨脂、狗脊、熟地黄、牛膝、当归、羌活、独活、红花、木瓜、川芎按2∶2∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1组成,药物剂量共132 g。具体制备方法参照文献[4]：以上药物加入20倍量的水煎煮两次,1.5小时/次,过滤,滤液以薄膜蒸发浓缩,至相对密度0.9～1.1(80℃)的浸膏,浸膏含生药量为1 g/mL(药物浓度为1 g/mL)。保存于4℃冰箱中备用。

1.5 兔退变椎间盘模型制备及NPMSCs移植方法

兔退变椎间盘模型制备参考文献[4],将兔直立在直径110 mm的PVC管中,每天连续固定5小时,连续8周；然后采用1.5 T核磁共振(美国GE公司生产)进行扫描,扫描参数(TR3000 ms,TE135 ms,层厚5 mm,层距1 mm),由放射科2位主治或以上医师阅片；参照Thompson分级法[5]进行评估,选取中度信号减弱(3级)的模型兔为受试对象。

NPMSCs移植方法参考文献[4],注射入的NPMSCs均使用第三代细胞,首先对受试动物耳缘静脉采用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉,待麻醉成功后,将其左侧仰卧位固定于手术台,然后对术区备皮、消毒、铺单,显露椎体及椎间盘,取L4-5、L5-6椎间盘用于实验。用10 mL的注射器穿刺进入椎间盘内约5 mm,负压抽吸髓核,其中L4-5椎间盘不注入任何物质,采用10 mL注射器负压抽吸髓核；L5-6椎间盘1 mL注射器注入NPMSCs细胞悬液约0.5 mL(细胞浓度为1×106mL)；然后依次缝合大白兔肌肉、皮肤。待动物苏醒后送回笼内饲养,术后予以每天一次肌注青霉8万单位/次,连续3天。

1.6 给药

大兔灌胃方法,参考文献[6],大白兔每日灌胃用药量=成人每日用药量/正常成人体重×换算常数×校正系数,按1 mL/(kg·d)灌胃大兔。A组：予生理盐水灌胃,3次/天；同时采用NPMSCs移植方法注射0.9%生理盐水0.5 mL,共1次。B组：给药同A组。C组：予补肾活血方浸膏灌胃,3次/天；同时采用NPMSCs移植方法注射0.9%生理盐水0.5 mL,共1次。D组：予生理盐水灌胃,3次/天；同时采用NPMSCs移植,共1次。E组：予补肾活血方侵膏灌胃,3次/天；同时采用NPMSCs移植,共1次。

以上5组观察时间点为治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后3周。

1.7 观察指标与检测方法

免疫组织化学染色分别于治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后3周时采用空气栓塞法处死各组大兔,每组每个时间点分别取6只(5组共30只)、5组4个时间段共120只大兔椎间盘；然后采用10%甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋、切片(层厚约4～6 μm)。采用酶联免疫法对椎间盘组织中P38MAPK、MMP-3、MMP-7含量进行测定,严格按试剂盒操作说明进行。

1.8 统计学处理

采用统计学软件SPSS 20.0处理,本研究数据均符合正态分布、方差齐,所有数据用均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行比较。以α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 各组大兔不同时间段椎间盘组织中P38MAPK蛋白相对表达比较

各组变化趋势：A组、B组在治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后3周4个时间点P38MAPK蛋白相对表达差异无统计学意义(P＞0.05)；C组、D组、E组P38MAPK蛋白相对表达在各时间点均呈下降趋势,差异有统计学意义(P＜0.01)。

与A组比较,B组、C组、D组、E组P38MAPK蛋白相对表达在各时间点均升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与B组比较,C组、D组、E组P38MAPK蛋白相对表达在治疗前差异无统计学意义(P＞0.05),在治疗后1周、2周、3周均降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。与C组比较,D组P38MAPK蛋白相对表达在各时间点差异无统计学意义(P＞0.05)；E组P38MAPK蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。与D组比较,E组P38MAPK蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。 见表1。

2.2 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-3蛋白相对表达比较

各组变化趋势：A组、B组在治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后3周时4个时间点MMP-3蛋白相对表达差异无统计学意义(P＞0.05)；C组、D组、E组MMP-3蛋白相对表达在各时间点均呈下降趋势,差异有统计学意义(P＜0.01)。

与A组比较,B组、C组、D组、E组MMP-3蛋白相对表达在各时间点均升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与 B组比较,C组、D组、E组 MMP-3蛋白相对表达在治疗前差异无统计学意义(P＞0.05),在治疗后1周、2周、3周均低于同期B组,差异有统计学意义(P＜0.01)。与C组比较,D组MMP-3蛋白相对表达在各时间点比较无统计学差异(P＞0.05)；E组MMP-3蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均低于同期C组,差异有统计学意义(P＜0.01)。与D组比较,E组MMP-3蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均低于同期D组,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.3 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-7蛋白相对表达比较

各组变化趋势：A组、B组在同组治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后3周时4个时间点MMP-7蛋白相对表达差异无统计学意义(P＞0.05)；C组、D组、E组MMP-7蛋白相对表达在各时间点均呈下降趋势,差异有统计学意义(P＜0.01)。

与A组比较,B组、C组、D组、E组MMP-7蛋白相对表达在各时间点均升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。与 B组比较,C组、D组、E组 MMP-7蛋白相对表达在治疗前差异无统计学意义(P＞0.05),在治疗后1周、2周、3周均低于同期B组,差异有统计学意义(P＜0.01)。与C组比较,D组MMP-7蛋白相对表达在同期各时间点差异无统计学意义(P＞0.05)；E组MMP-7蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均低于同期C组,差异有统计学意义(P＜0.01)。与D组比较,E组MMP-7蛋白相对表达在治疗后1周、2周、3周均低于同期D组,差异有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表1 各组大兔不同时间段椎间盘组织中P38MAPK蛋白相对表达比较(±s)

表1 各组大兔不同时间段椎间盘组织中P38MAPK蛋白相对表达比较(±s)

注：与假手术组比较aP＜0.01,与模型组比较bP＜0.01,与补肾活血方组比较cP＜0.01,与NPMSCs移植组比较dP＜0.01。

组别 兔数 治疗前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后3周A组0.19±0.03 0.20±0.03 0.20±0.02 0.21±0.04 B 组 6 0.64±0.05a 0.67±0.04a 0.68±0.03a 0.67±0.04a C 组 6 0.63±0.04a 0.58±0.05ab 0.51±0.04ab 0.44±0.05ab D 组 6 0.64±0.04a 0.59±0.04ab 0.50±0.06ab 0.42±0.04ab E 组 6 0.64±0.02a 0.52±0.06abcd 0.41±0.05abcd 0.34±0.06 6 abcd

表2 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-3蛋白相对表达比较(±s)

表2 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-3蛋白相对表达比较(±s)

注：与假手术组比较aP＜0.01,与模型组比较bP＜0.01,与补肾活血方组比较cP＜0.01,与NPMSCs移植组比较dP＜0.01。

组别 兔数 治疗前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后3周A组101.5±9.4 100.7±10.5 103.2±9.7 103.7±10.5 B 组 6 239.7±16.3a 242.4±15.1a 243.6±16.0a 243.0±15.8a C 组 6 240.6±17.2a 214.3±18.0ab 192.5±15.6ab 175.4±16.7ab D 组 6 238.5±18.6a 212.4±18.7ab 193.8±16.2ab 174.0±17.5ab E 组 6 239.0±17.4a 199.5±20.4abcd 172.3±15.8abcd 146.7±18.2 6 abcd

表3 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-7蛋白相对表达比较(±s)

表3 各组大兔不同时间段椎间盘组织中MMP-7蛋白相对表达比较(±s)

注：与假手术组比较aP＜0.01,与模型组比较bP＜0.01,与补肾活血方组比较cP＜0.01,与NPMSCs移植组比较dP＜0.01。

组别 兔数 治疗前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后3周A 组 6 110.8±12.3 111.5±11.7 110.4±10.8 112.6±12.0 B 组 6 386.7±27.3a 387.9±26.5a 389.5±27.1a 389.4±26.8a C 组 6 387.8±25.9a 312.1±26.4ab 270.7±25.2ab 206.8±24.1ab D 组 6 389.6±26.5a 310.5±24.8ab 269.5±26.7ab 204.2±25.8ab E 组 6 387.5±27.7a 273.6±29.0abcd 224.3±26.4abcd 176.5±28.2abcd

3 讨论

腰腿痛等脊柱相关疾病是劳动人群致残的主要原因[7],其病理改变的前提及基础为腰椎间盘退变。椎间盘中含丰富的细胞外基质,其主要成分为水、胶原、蛋白多糖及少量弹性蛋白等；并且椎间盘内各种降解酶和抑制物一般共同存在且呈潜伏状态；正常情况下,胞外基质处于不断分解与合成的动态平衡之中,当这一平衡破坏,可造成椎间盘细胞外基质成分改变,引起髓核脱水而失去固有弹性,逐渐使椎间盘内环境及机械作用发生改变,最终导致椎间盘基质分解,髓核突出对神经根或脊髓进行性压迫,导致相应神经产生不可逆损伤[3]。

研究显示[3],P38MAPK信号转导途径在椎间盘退变过程中可能处于枢纽地位,对炎症、应激反应的调控密切相关,其中MMP-3、MMP-7的表达在椎间盘退变组织中表达明显增加。提示基质金属蛋白酶对椎间盘退变发挥重要调控作用。基质金属蛋白酶,为细胞外重要的降解酶类,能够激活细胞因子、生长因子、抑制因子及椎间盘细胞；其中MMP-3、MMP-7是MMPs家族的成员之一,可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型胶原及软骨中蛋白多糖中的核心蛋白,使糖蛋白和连接蛋白裂解为高度异质性分子,影响椎间盘突出重吸收[8]。

研究显示[9-11],髓核功能细胞数量减少和细胞外基质(extral celluar matrix,ECM)合成减少是椎间盘退变中最重要的两个表现；椎间盘生物学修复的关键所在是以髓核内足够的活力细胞为前提,进而增加ECM的合成、修复或延缓椎间盘退变,目前以细胞为基础修复椎间盘退变的动物实验研究得到了一定成果。其中NPMSCs是一种来源于髓核组织的间充质干细胞,其移植治疗不但可以增加椎间盘原始细胞活力,而且还可以在髓核内环境因素刺激下向髓核样细胞分化,补充细胞数,可起到修复椎间盘退变的效果[12-14]。

椎间盘退变,根据其临床特征,可归属于祖国医学“痹证”范畴,《内经》云：“腰为肾之腑。”肾虚为本,瘀血为标,治疗上应补肾活血通络。补肾活血方是以骨碎补、补骨脂、狗脊为君药,补肾壮骨；以熟地、牛膝、当归 、羌活、独活为臣药,以加强补肾之力,兼以祛风止痛；辅以红花、木瓜、川芎活血化瘀；采取的是“扶正祛邪,内外同治”的治疗原则,以达标本兼治。梁龙等[15]研究表明,针对腰椎间盘突出症患者,补肾活血法能显著缓解患者的疼痛、改善其功能活动；杨届等[16]研究指出补肾活血汤可抑制及P38MAPK蛋白的表达,可延缓椎间盘退。

本研究结果表明,椎间盘退变兔椎间盘组织中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相对表达均明显增高,经补肾活血方、兔NPMSCs移植、补肾活血方+兔NPMSCs移植干预的组别兔椎间盘组织中 P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相对表达均呈不同程度下降趋；其中,补肾活血方、兔NPMSCs移植治疗退变椎间盘兔椎间盘组织中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相对表达组间无差异,而补肾活血方+兔NPMSCs移植干预退变椎间盘兔组椎间盘组织中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相对表达均低于补肾活血方、兔NPMSCs移植治疗组,提示补肾活血方对兔NPMSCs移植治疗退变椎间盘具有协同作用；其机制可能与抑制P38MAPK信号通路,下调MMP-3、MMP-7蛋白相关。