不同表面样式引导骨再生生物膜对细菌黏附能力影响的研究

储顺礼，崔 岩，周延民，李娴静，李 威

(1.吉林大学口腔医院 种植科，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院；3.吉林大学中日联谊医院 检验科)

生物材料应用于人体，对医学进步做出了显著贡献，然而，生物材料在植入人体初期也扮演着异物的角色，也会为细菌定植提供了合适的场所[1]。在口腔骨缺损再生治疗中，引导骨再生(GBR)生物膜必不可少，临床应用中由于组织张力过大经常会出现生物膜暴露感染，关于生物膜表面细菌黏附定植对比研究国内外甚少，本研究基于此，研究不同表面样式引导骨再生生物膜对变形链球菌黏附的影响，以期获得相关参数，从而指导生物膜的临床应用以及研发。

1 材料和方法

1.1 实验材料

依据专利[2]，采用盐析法制备出PPC[聚碳酸亚丙酯，poly(propylene carbonate),简称PPC] / PBS[聚琥珀酸丁二酯，poly(butylene succinate),简称PBS] 引导骨再生生物膜(简称PPC/PBS膜)，修剪成5 mm×5 mm大小，环氧乙烷熏蒸消毒后备用；海奥生物膜(20 mm×25 mm)购自于烟台正海生物科技股份有限公司，修剪成5 mm×5 mm大小后环氧乙烷熏蒸消毒备用。变形链球菌336931购自于北纳创联生物技术有限公司；BHI血琼脂平板。

1.2 实验分组及表面形态检测

采用盐析法制备的PPC/PBS膜以及市售的海奥生物膜，依据其表面形态，可以分为粗糙面和光滑面，对四种样式的表面进行分组，依次为PPC/PBS膜多孔面组、PPC/PBS膜光滑面组(依据专利制备的PPC/PBS基引导骨再生生物膜表面其中一面非常光滑，孔很少很小，记为PPC/PBS膜光滑面，另外一面非常粗糙，有很多相通的孔，记为PPC/PBS膜多孔面)、海奥膜非UP面组、海奥膜UP面组(海奥生物膜表面其中一面印有UP字样，该UP面相对较为致密，另一面无UP字样，相对较为粗糙，临床操作中非UP面与骨缺损直接接触，UP面与软组织相接触)。对上述四组表面形态结构进行扫描电镜检测。

1.3 细菌黏附实验

将实验用变形链球菌336931菌株接种于BHI琼脂平板，进行复苏培养，形态学检查为纯培养物，厌氧培养48 h，制成浓度为6×108的菌悬液。将上述四组生物膜分别置于24孔培养板，实验面朝上，生物膜周边应用橡皮泥填平(防止菌液从周边渗透进入非实验面)，应用口腔正畸用金属结扎丝将其固定位于培养板的最底部保持稳定，环氧乙烷熏蒸消毒后，各加入0.2 ml细菌悬液，置入厌氧培养罐内，37℃恒温培养24 h后取出生物膜，用PBS缓冲液清洗5次。然后每个样本置入离心管内加入PBS缓冲液 2 ml，超声洗涤60 s，收集原液并进行10倍倍比稀释至10-3。取10 μl菌液接种于BHI琼脂平板上厌氧培养48 h进行菌落生长数量计数。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 扫描电镜观察各样本表面形貌结果显示两种生物膜具有不同孔大小的表面结构形态。海奥膜光滑面较为致密，胶原束排列较不规则稍显松散，粗糙面较为疏松，可见胶原纤维呈束状排列，相邻胶原束排列较松散 。PPC/PBS膜光滑面表面非常光滑致密，很平整，微米级孔很少见。多孔面呈多孔状，表面均为微米级孔所覆盖，孔大小不一，大孔孔径约200 μm，平均孔径约120 μm。具体见下图1所示。

2.2 静态培养状态下两组试件表面变形链球菌黏附数的比较菌落计数结果显示：PPC/PBS多孔面和海奥膜非UP面黏附数最多，两者无统计学差异，其次是海奥膜UP面，数量次之，最少的是PPC/PBS膜光滑面，数量最少，PPC/PBS膜光滑面与其它组相比较差异有显著性，海奥膜UP面与其它组相比差异有显著性,具体数据见表1。

图1 扫描电镜下两种生物膜表面形态(A：海奥膜UP面；B：海奥膜非UP面；C：PPC/PBS膜光滑面；D：PPC/PBS膜多孔面)

表1 变形链球菌24 h黏附量的菌落形成单位计数(1×105CFU/mm2,Mean±SEM)

3 讨论

口腔微生态系统是由微生物、宿主与口腔环境之间相互作用、相互依赖而组成的统一整体。但当外源物进入口腔内可能会改变口腔微生态环境，破坏口腔微生态平衡从而引发炎症等[3]。在临床骨缺损中广泛应用的GBR生物膜即属于外源物，然而，在GBR操作中，由于植入物导致局部张力很大，再加上术后局部的水肿，往往会造成软组织创口术后裂开，生物膜易暴露于口腔微环境中。这种生物膜一旦暴露于口腔微生态环境中，口腔微生物势必会附着于表面，这在一定程度上影响了GBR的效果甚至会导致局部的感染引起失败等。

微生物发挥致病性的首要步骤是在宿主或者外源物表面的黏附[3]。细菌的黏附被认为在感染的发病机制中起着重要作用。影响细菌黏附的因素较多，主要包括三个方面：修复体材料(如修复材料的表面结构粗糙度等)、微生物(如微生物的种类等)、宿主(如口腔卫生等)[4,5]。有研究表明材料表面细菌的黏附量与材料的粗糙程度有一定的相关性，表面结构越粗糙，细菌黏附量增多，粗糙的表面可为细菌提供附着的场所并产生屏蔽效应，对细菌在材料表面的早期黏附量有重要影响[6,7]。在本研究扫描电镜结果显示，PPC/PBS膜光滑面十分光滑，海奥膜UP面相对较为致密光滑，而PPC/PBS膜多孔面、海奥膜非UP面均较为粗糙。若依据上述表面结构粗糙与细菌黏附相关性推测：PPC/PBS膜光滑面和海奥膜UP面表面相对更为致密，细菌的黏附相对较少，而PPC膜多孔面、海奥膜非UP面表面十分粗糙相对更有利于细菌的黏附。

变形链球菌是口腔主要致病菌之一，属于最早定植菌，对牙齿等口内物表有很高的亲和力，为后续细菌定植等提供便利[8]。因此本研究选用变形链球菌进行对比研究。本实验结果提示，在相同培养条件下，PPC/PBS膜光滑面和海奥膜UP面表面黏附的细菌量明显低于PPC/PBS膜粗糙面、海奥膜粗糙面，且PPC/PBS膜光滑面也地狱海奥膜UP面，差异有显著性。这也与扫描电镜结果相一致，PPC/PBS膜光滑面呈现的表面形态非常光滑致密，不利于细菌的黏附定植；海奥膜UP面次之；而表面相对较为粗糙的PPC/PBS膜粗糙面、海奥膜粗糙面其表面形态更有利于细菌的黏附。这与Badih[9]的研究结果相类似，材料粗糙度越大，细菌越容易黏附。

GBR生物膜主要应用于引导骨再生中隔绝软组织细胞进入到骨再生空间，都具有两个表面，一面贴附于骨缺损直接与骨或骨替代材料接触，另一面贴附于软组织与软组织创口直接接触。上述变形链球菌在不同表面结构生物膜材料表面具有不同的黏附特性提示我们，为防止或尽量减少细菌在GBR生物膜表面黏附，建议临床上在条件允许的情况下应尽量选用其中一面为更为光滑的GBR生物膜，且在临床应用中不可以将生物膜多孔面和光滑面位置颠倒，以免细菌在生物膜表面聚集影响骨再生效果。