恒清Ⅰ号方对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的保护作用研究

孟胜喜，霍清萍，王 兵，彭文波，王宇新，梁 芳，汪天湛，张洪艳，余忠海，彭学丰，李学敏，曹健美，李文涛

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是出血性脑病、缺血性脑病等脑血管疾病引起的认知功能障碍综合征，VD是仅次于阿尔茨海默病引起老年痴呆的第二大常见诱因[1]。目前全球痴呆病人约3 600万人，预计2030年将达到6 600万人，2050年将达到1.1亿人左右[2]，这给社会和家庭带来沉重的经济和社会负担，因此，寻找有效的治疗VD药物迫在眉睫[3-4]。由于中药具有多途径、多靶点、多层次作用特点和优势，因此，在防治VD方面发挥重要作用。恒清Ⅰ号方是本课题组治疗VD经验方，本研究观察恒清Ⅰ号方对VD大鼠Morris水迷宫的作用，探讨恒清Ⅰ号方对VD大鼠空间学习、记忆能力的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用3月龄体重250～300 g清洁级健康雄性SD大鼠36只，购自上海灵畅生物科技有限公司[合格证编号：SCXK(沪)2018-0003]，饲养环境：温度22～24 ℃，自由进食、饮水，适应性饲养1周。

1.2 实验药物 奥拉西坦胶囊(商品名为欧来宁，国药准字：H20031033，批号：059190102，石药集团欧意药业有限公司生产，每粒0.4 g)。中药恒清Ⅰ号方的药物组方：益智仁30 g，菟丝子15 g，川芎15 g，石菖蒲20 g，熟地黄15 g，杜仲15 g，地龙10 g，郁金15 g，天麻10 g，钩藤10 g。中药材均由上海市第六人民医院提供，符合2015年版《中国药典》要求。按处方比例称取药材，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，过滤，合并3次滤液，37 ℃水浴加热浓缩，根据临床实际用药情况，对药液进行浓缩处理，并以中质量浓度匹配临床实际用药浓度。中质量浓度浓缩至0.535 g/mL，置于4 ℃冰箱贮存备用。

1.3 实验仪器 Morris水迷宫型号：JLBehv-MWMG-1，上海吉量软件科技有限公司生产。Morris水迷宫主要用于测试实验动物(大鼠、小鼠)空间位置觉和方向觉的学习及记忆能力[5]，包含一个黑色池内壁的泳池、图像采集系统和软件分析系统。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 适应性饲养1周后将36只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组，各9只。

1.4.2 模型制备 参照文献[6]以双侧颈总动脉结扎术制备VD模型。所有大鼠术前12 h禁食、4 h禁水，先称重，以2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射充分麻醉后，采用仰卧位固定大鼠，颈前区去毛，碘伏消毒，颈正中切口处纵向切开皮肤和皮下组织，颈部肌肉进行钝性分离，使双侧颈总动脉鞘游离，分离颈总动脉、迷走神经等，充分显露双侧颈总动脉。模型组、奥拉西坦组及恒清Ⅰ号方组大鼠均以4-0号缝线双重结扎颈总动脉，再以0号缝线对皮肤进行缝合，最后碘伏进行消毒。假手术组大鼠均按上述方式麻醉、消毒，在颈正中行纵形切口，双侧颈总动脉钝性分离后，即缝合手术切口；同时白炽灯照射大鼠，使其肛温维持在37 ℃左右，苏醒后，放回鼠笼继续饲养。

1.4.3 药物干预 造模7 d后，奥拉西坦组给予奥拉西坦溶液(奥拉西坦胶囊加入生理盐水中配制而成)灌胃，每日2次。恒清Ⅰ号方组给予恒清Ⅰ号方灌胃，每日2次；奥拉西坦溶液或恒清Ⅰ号方给药浓度，根据人和动物体表面积折算系数换算[7]，计算结果为14.8 g/kg。假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，每日2次。

1.4.4 Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力 干预4周、8周后，分别进行Morris水迷宫实验，测试大鼠空间学习和记忆能力。Morris水迷宫行为学测试包括定位航行实验和空间探索实验。

1.4.4.1 定位航行实验(测试大鼠空间学习能力) 随机选择一个象限的池壁中点作为入水点，将大鼠面向池壁轻轻放入水中，Morris水迷宫软件程序记录大鼠从入水到成功爬上水下平台所需的时间，即逃避潜伏期(escape latency，EL)。若经过120 s后大鼠未找到平台，则人为引大鼠至平台休息30 s；否则EL为120 s。测试结束后，不管大鼠是否爬上平台，均应保持大鼠在平台上停留学习30 s，且相邻象限时间间隔不少于15 min。每只大鼠均测试4次，取平均值作为最终测试结果。

1.4.4.2 空间探索实验(测试大鼠空间记忆能力) 定位航行实验完成次日，移走平台，选取与之前平台所在象限相对的象限中点作为大鼠入水点，让大鼠进行120 s自由游泳，记录120 s内大鼠为寻找平台而在平台象限游泳时间占总时间百分比，即原平台所在象限停留时间与总时间比值(percentages of time spent in the target quadrant，PTSTQ)。

2 结 果

2.1 恒清Ⅰ号方对VD大鼠空间学习能力的影响 干预4周后，与假手术组比较，模型组、奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组大鼠EL均延长，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组大鼠EL均缩短，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，恒清Ⅰ号方组EL与奥拉西坦组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。干预8周后，与假手术组比较，模型组、奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组大鼠EL均延长，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组大鼠EL均缩短，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与奥拉西坦组比较，恒清Ⅰ号方组大鼠EL缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。奥拉西坦组干预8周与干预4周比较，EL无明显变化(P>0.05)；恒清Ⅰ号方组干预8周EL较干预4周明显缩短(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠EL比较(±s) 单位：s

2.2 恒清Ⅰ号方对VD大鼠空间记忆能力的影响 干预4周后，与假手术组比较，模型组、奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组大鼠PTSTQ均减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组PTSTQ均增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；恒清Ⅰ号方组PTSTQ与奥拉西坦组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。干预8周后，与假手术组比较，模型组、奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组PTSTQ均减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，奥拉西坦组和恒清Ⅰ号方组PTSTQ均增加，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与奥拉西坦组比较，恒清Ⅰ号方组PTSTQ增加，差异有统计学意义(P<0.05)。奥拉西坦组干预8周PTSTQ与干预4周比较，差异无统计学意义(P>0.05)；恒清Ⅰ号方组干预8周PTSTQ高于干预4周(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠PTSTQ比较(±s) 单位：%

3 讨 论

VD属中医学“愚痴”“痴呆”“善忘”等范畴。中医学认为该病病位在脑，病机为本虚标实、虚实夹杂。本虚为肾精亏虚，标实为风、火、痰、瘀互结内阻。

恒清Ⅰ号方是本课题组治疗VD经验效方，其以益智仁为君药，以川芎、石菖蒲、熟地黄、杜仲、地龙、郁金为臣药，以天麻、钩藤为佐使药，共同发挥补益肾精、化痰祛浊、活血化瘀作用，从而充养髓海，恢复神智。前期临床研究已证实，恒清Ⅰ号方可显著改善VD病人认知功能，疗效明显优于单纯西药尼莫地平治疗，且安全性良好[8]，且恒清Ⅰ号方与多奈哌齐联用可提高VD病人长谷川痴呆量表、简易精神状态量表与日常生活能力量表评分，疗效显著。其药物作用机制可能是改善VD病人血液流变学指标，减轻炎症反应，降低氧化损伤，改善微循环，修复神经元细胞，保护中枢神经元，从而改善VD病人日常生活能力及认知功能。

现代药理研究已证实，益智仁水提物通过抑制SD大鼠乙酰胆碱酯酶活性，增加海马蛋白含量，改善东莨菪碱所致大鼠记忆获得障碍[9]；菟丝子多糖可降低应激状态下小鼠大脑皮质中脂质过氧化物丙二醛含量及增加超氧化物歧化酶活性，通过抗脂质过氧化保护脑组织[10]。川芎主要有效成分川芎嗪通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)通路以减轻缺血导致的大脑炎症，下调神经元一氧化氮合酶以保护脑部神经[11]；石菖蒲水煎液能改善阿尔茨海默病小鼠空间学习记忆能力[12]；熟地黄可改善D-半乳糖衰老模型大鼠学习记忆能力，提高脑组织抗氧化能力，减缓其脑细胞衰老[13]。杜仲皮通过激活c-Jun氨基末端激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)、糖原合酶激酶-3(GSK-3β)和核因子κB(NF-κB)通路减弱氧化应激，保护神经元细胞免受细胞凋亡[14]。地龙可促进神经细胞再生，修复损伤后神经功能，其水提取液能改善局灶性脑缺血再灌注损伤大脑皮层损伤[15]。郁金水煎剂可明显降低全血黏度，减少血小板聚集，郁金醇提物可明显降低血浆纤维蛋白含量，减少血栓形成[16]。天麻有效成分巴利森苷能减轻小鼠空间学习记忆能力损伤[17]；钩藤有效成分异钩藤碱可保护脑细胞、减缓痴呆，其机制是通过清除过氧化脂质体及代谢产物、抗氧化、抑制谷氨酸损伤[18]。

本研究结果表明，与模型组比较，药物干预组(恒清Ⅰ号方组和奥拉西坦组)干预4周、干预8周大鼠EL均缩短，PTSTQ均增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；奥拉西坦组干预8周与干预4周比较，EL和PTSTQ无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。与干预4周比较，恒清Ⅰ号方组干预8周EL缩短，PTSTQ增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与奥拉西坦组干预8周比较，恒清Ⅰ号方干预8周EL均缩短，PTSTQ均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，恒清Ⅰ号方可明显改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，且干预8周效应优于干预4周效应，且优于奥拉西坦干预8周效应。