全自动免疫组化预处理仪在改良EBER原位杂交检测中的应用

林 蓁，杨文圣

EB病毒(EB virus, EBV)，全世界约95%的成人携带此病毒，其与许多肿瘤性疾病及非肿瘤性疾病关系密切，其中EBV相关淋巴组织疾病更是病理诊断中较为困难的领域。EB病毒检测不同方法可能检测结果会有所差异，我们选择原位杂交方法，其主要优点在于原位，可以对靶序列进行组织、细胞的空间定位。原位杂交检测具有敏感性高、特异性强、定位清晰，是目前较公认检测EBV的金标准。如何在现有实验室条件，做好质控显得十分必要。本科室对传统方法进行改良，节省了检测时间，实验效果更佳，结果更加稳定，现分享如下。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取2017年1月～2019年1月送厦门大学附属成功医院病理科检测EBER的组织90例。

1.2 试剂与仪器EBER试剂盒(泰普生物中国公司)、EDTA组织修复液(pH 9.0，Dako公司)、PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)、全自动免疫组化预处理仪(PT200，Dako公司)、电热恒温箱、徕卡切片机。

1.3 方法(1)切片与脱蜡：石蜡组织3 μm厚切片，黏附2张洁净防脱载玻片上均分2组，65 ℃烤片30 min。二甲苯3 min×2，无水乙醇3 min×2，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，流水3 min。(2)预处理、变性、杂交：①传统方法，预处理、变性、杂交：蛋白酶K消化5 min、55 ℃孵育变性60 min、37 ℃恒温杂交过夜。②改良方法，预处理：将EDTA(50×)修复液装入全自动免疫组化预处理仪中，开启预处理程序加热预温到85 ℃后，将切片浸没入修复液中，继续预处理程序，进行98 ℃ 20 min的组织渗透；程序结束，取出切片PBS缓冲液3 min，蒸馏水1 min；变性、杂交：根据组织大小移液15～20 μL适量杂交液，加洁净盖玻片覆盖组织切面。切片水湿盒55 ℃恒温孵育变性60 min取出；放置装杂交增强液的孵育盒，37 ℃恒温杂交60 min。(3)免疫显色、切片复染：切片小心移去盖玻片，放置加热至48～50 ℃ PBS缓冲液2 min×3，充分摇荡，拭去组织周边缓冲液，滴加一抗50 μL，37 ℃水湿盒孵育30 min；取出切片37 ℃ PBS缓冲液3 min×2，充分摇荡。拭去组织周边缓冲液，滴加二抗50 μL，室温孵育20 min；取出切片PBS缓冲液2 min×3，充分摇荡。拭去组织周边缓冲液，滴加HRP 50 μL，室温水湿盒孵育30 min；取出切片，PBS缓冲液2 min×3，充分摇荡。拭去组织周边缓冲液，滴加适量新鲜配置DAB显色2 min左右，显微镜下控制时间。切片苏木精适度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 结果判定实验结果判读，组织细胞核内出现明显棕褐色颗粒即判为阳性，未出现棕褐色颗粒判为阴性。

2 结果

90例检测EBER组织中，传统方法阳性检出37例、阴性53例；改良方法阳性检出39例、阴性51例(表1)。两组检测阴性、阳性结果差异无统计学意义(P=0.763)。改良方法：阴性病例背景干净无表达，阳性病例信号表达强、明显清晰(图1)；阳性信号拷贝数少信号弱的病例，阳性信号仍清晰可辨(图2)。

表1 改良与传统原位杂交检测EBER结果对比[n(%)]

①②

3 讨论

原位杂交方法检测石蜡包埋组织中EBER，对组织进行适当预处理，使组织通透性增强，易于已知标记探针进入细胞内与待测靶mRNA杂交，操作中存在各种影响因素，想要做好质控，组织渗透环节十分关键。传统方法常首选蛋白酶K，亦有选择胃酶增强组织通透性的[1]，这种广泛去蛋白作用在增强组织通透性和核酸探针穿透性，提高杂交信号的同时，也会使靶核酸减少，对组织结构的形态也有一定的影响，所以在通透组织的试剂用量和时间上都要有较好的掌握[2]。消化不足组织核酸暴露不充分，阳性信号减弱或不显示。消化过度核酸周围组织的蛋白结构会被破坏，在接下来的实验中核酸易丢失呈假阴性或阳性信号减弱[3]。

有文献报道[4]将高压热修复用于石蜡包埋组织原位杂交修复。启发我们对增强组织通透性环节进行改良，实验表明改良效果甚好。推论其原理可能是对组织进行高温热渗透预处理时，可以使组织细胞周围蛋白通路打开，增加组织通透性较好促进了探针渗透，充分与待测的靶mRNA杂交。

改良法可以对组织进行单独或批次的预处理。满足特殊组织要求，标本量多时更具优势，提高工作效率。Dako的EDTA修复液还具有脱蜡作用，二次脱蜡确保组织脱蜡完全，更易探针充分渗透；预处理温度不超过100 ℃，不容易引起组织切片掉片；仪器自动恒温加热不必担心修复液浓度变化、干涸等不良现象；且温度图谱可视具体温度量化值，做到实时监测。整个预处理过程可控、快捷、稳定，定奠了后续原位杂交质量的保证。

目前试剂盒多采用地高辛标记探针，杂交需4～16 h甚至过夜。改良法，渗透效果得到更好保证，使之后组织细胞中靶mRNA与探针充分接触，杂交所需时间缩短到1 h，整个实验流程只需4～5 h。可与Ventana全自动免疫组化仪EBER原位杂交检测需要时间相近，较传统方法时间大大减少，亦同样取得很好结果。

Dako全自动免疫组化预处理方法，目前本组病例数有限，实验也可能还存在瑕疵，但改良效果明显。与传统酶消化渗透方法检测结果无明显差异，阳性率基本一致；阳性信号表达更清晰可辨；特别在阳性拷贝数较低的病例更具优势。Dako全自动控制的预处理渗透程序，整体流程省时、便捷，检测结果稳定，改良法是一种值得推荐的病理实验室检测EBER的方法。