卵巢浆液性癌中miR-203和miR-595表达与预后的关系

柯艺文，吴 春，张 馨

微小RNA(microRNA, miR)是一类高度保守的非编码小RNA分子，在转录后水平调节基因表达，在细胞增殖、凋亡、侵袭、血管再生等多种生理病理过程中起重要作用。目前已发现多个miR可作为卵巢浆液性癌的独立预后因子，如miR-613[1]、miR-21[2]等。miR-203定位于人染色体14q32-33，为特异性上皮miR，文献报道miR-203在不同类型肿瘤中的表达水平存在差异，如miR-203在喉癌中表达降低[3]，而在乳腺癌中表达增加[4]，目前关于miR-203在卵巢癌中的表达情况尚不明确。Tian等[5]研究发现，miR-595在卵巢癌组织样本及细胞株中均表达下降，而关于miR-595在卵巢浆液性癌中的表达情况相关研究甚少。本实验采用RT-PCR技术检测卵巢浆液性癌组织中miR-203、miR-595的表达情况，探讨其表达与患者病情进展、预后的关系，并评估其在卵巢浆液性癌预后预测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料收集2011年1月～2014年11月海南省海口市妇幼保健院行手术治疗的卵巢浆液性癌手术组织样本(癌组织及癌旁正常组织)，共收集45例符合标准的卵巢浆液性癌标本。纳入标准：病历资料完整，术前未接受放、化疗及激素治疗，术后病理诊断为卵巢浆液性癌，完成术后随访。排除标准：合并感染性疾病；合并严重器质性疾病；合并其他恶性肿瘤。本实验经本院伦理委员会审核通过，组织样本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。采用门诊复查或电子通讯方式，对患者进行为期5年的术后随访，直至随访时间截止或患者死亡，本组45例患者中位随访时间为(48.09±7.49)个月。Trizol(美国Invitrogen公司)，miRcute miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化公司)，反转录试剂盒(上海碧云天生物公司)，逆转录引物及RT-PCR引物(金斯瑞生物公司)，SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)，紫外分光光度计(美国Thermo公司)，RT-PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 RT-PCRmiRcute miRNA提取分离试剂盒提取组织中的miRNA，反转录试剂盒合成cDNA，miR-203逆转录引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAG TGGT-3′，miR-595逆转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAG-3′。SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒进行RT-PCR试验，所有操作均严格遵守试剂盒说明书，RT-PCR引物：miR-203正向引物5′-ACACTCCAGCTGGCGTGAAATGTTTAGGACCA-3′，反向引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；miR-595正向引物5′-GCGGCAACCCGTAGATCCGAA-3′，反向引物5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-CGCTTCGGCAGCACATATA C-3′，反向引物5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，合计40个循环，以2-ΔΔCt计算miR-203、miR-595的相对表达量。

2 结果

2.1 卵巢浆液性癌中miR-203、miR-595的表达RT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，卵巢浆液性癌组织中miR-203相对表达量增加，而miR-595相对表达量降低，差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢浆液性癌组织中miR-203、miR-595的表达

2.2 卵巢浆液性癌中miR-203、miR-595表达与临床病理特征的关系卵巢浆液性癌中miR-203表达与患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、CA125表达无关(P均>0.05)，与淋巴结转移、FIGO分期有关(P均<0.05)；miR-595表达与患者年龄、肿瘤直径、CA125无关(P均>0.05)，与组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期相关(P均<0.05，表2)。

2.3 miR-203、miR-595表达与卵巢浆液性癌患者预后的关系以miR-203表达量中位数(2.96)为界，将卵巢浆液性癌患者分为miR-203高表达组(22例)和miR-203低表达组(23例)，Kaplan-Meier结果显示，miR-203高表达组患者的术后5年总生存率为18.19%(4/22)，中位生存时间为26.57个月，miR-203低表达组患者的术后5年总生存率为47.83%(11/23)，中位生存时间为39.54个月，两组相比差异有统计学意义(Log-rank χ2=5.306，P=0.021，图1)。

以miR-595表达量中位数(0.30)为界，将卵巢浆液性癌患者分为miR-595高表达组(22例)和miR-595低表达组(23例)，Kaplan-Meier结果显示，miR-595高表达组患者的术后5年总生存率为50.00%(11/22)，中位生存时间为36.27个月，miR-595低表达组患者的术后5年总生存率为17.39%(4/23)，中位生存时间为30.28个月，两组相比差异有统计学意义(Log-rank χ2=4.311，P=0.038，图1)。

2.4 Cox回归模型分析卵巢浆液性癌预后的影响因素建立Cox比例回归模型，因变量为卵巢浆液性癌预后状况，选择组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期、miR-203表达、miR-595表达等5个指标为自变量，回归过程采用逐步后退法，以行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。结果显示：淋巴结转移、较高FIGO分期、miR-203高表达、miR-595低表达是卵巢浆液性癌患者预后的独立危险因素(P均<0.05，表3)。

表2 卵巢浆液性癌中miR-203、miR-595表达与临床病理特征的关系

表3 卵巢浆液性癌预后影响因素的分析结果

图1 Kaplan-Meier曲线分析miR-203、miR-595表达与患者预后的关系：A.miR-203；B.miR-595

2.5 联合检测miR-203、miR-595对卵巢浆液性癌的预后预测价值

2.5.1各指标单独应用对预后的预测价值 以本组中死亡病例(30例)为阳性样本，生存病例(15例)为阴性样本，再将卵巢浆液性癌组织中miR-203、miR-595以及当前临床上已用的血清CA125等共3个指标水平划分成7～9个组段，建立ROC诊断分析模型。经ROC分析结果显示：三指标均具有一定的卵巢浆液性癌预后预测价值，ROC曲线下面积(AUC)均在0.74以上。在其理论阈值点处，敏感度和特异度也均大于0.7(表4，图2)。

2.5.2三指标联合应用对预后的预测价值 以该三指标各自的阈值为诊断阈值，对各样本作阴性或阳性判断。若三指标均为一致阳性或阴性时作出样本的阳或阴性诊断，有一个指标不一致时则对其进行复测，复测未改变时即认可两指标相同的诊断结果，同时与临床医师会商。如此计算得：血清CA125、癌组织中miR-203、miR-595联合检测诊断的灵敏度和特异度分别为0.900(27/30)和0.867(13/15)。这说明三指标联合应用较之于各指标单独应用，可使对卵巢浆液性癌的预后预测效能得到明显的提升(表4)。

表4 miR-203、miR-595对卵巢浆液性癌诊断的ROC结果

3 讨论

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但病死率居妇科肿瘤的首位。约90%卵巢癌为卵巢浆液性癌，每年新发病例数约22万，死亡病例数约14万，严重威胁女性生命健康[6]。目前的临床治疗方案可显著提高患者的生存质量，但晚期患者的5年总生存率较低。此外，卵巢浆液性癌发病隐匿，临床上亟需寻找灵敏度高的诊断及预后预测的生物标志物，以提高患者的早期诊断率、改善患者预后。卵巢癌近年来，在肿瘤诊断及治疗方面取得了较大进展，但卵巢癌患者的5年存活率仍较低，缺乏有效的早期筛查敏感性和特异性均较高的生物标志物是重要原因之一。近年研究发现，miR是较为理想的卵巢癌生物标志物。

CA125是临床应用最广泛的血清肿瘤标志物，在卵巢癌晚期患者中，其血清水平升高明显，但近50%早期卵巢癌患者的血清CA125水平无变化，对早期患者的诊断灵敏度不高，且其血清水平易受多种生理(如妊娠等)、病理(如子宫内膜异位症等)状态影响，导致其临床应用受到限制[7]。

图2 miR-203、miR-595、CA125对卵巢浆液性癌预后预测的ROC曲线：A.miR-203；B.miR-595；C.CA125

研究证实，miR-203与卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌等妇科肿瘤关系密切[8]。本实验结果显示，与癌旁正常组织相比，癌组织中miR-203表达增加，提示miR-203异常高表达可能参与了卵巢浆液性癌的发生，发挥促癌基因作用。Zhao等[9]认为miR-203可抑制卵巢癌细胞的上皮-间质转化过程，发挥抑癌基因功能，与本结论相悖，笔者初步分析，这可能是组织样本与细胞株之间的差异所致，后续研究将在细胞水平进一步论证本实验结论；此外，本实验结果发现，癌组织中miR-203高表达与淋巴结转移、较高FIGO分期相关，miR-203高表达患者的术后5年总生存率低、中位生存时间短，初步证实miR-203高表达可诱发卵巢浆液性癌的发生及恶性进展。Cox回归模型结果显示，miR-203高表达是影响患者预后的独立危险因素，以上结果证实，miR-203具有作为卵巢浆液性癌生物标志物的潜能。

miR-595是近年研究发现的新miR分子，其功能尚未明确，有研究证实miR-595异常表达与骨髓增生异常综合征[10]、下颌前突[11]相关，且可作为肝硬化[12]、炎症性肠病[13]的生物标志物。本实验发现miR-595在卵巢浆液性癌组织中表达降低，且与组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期及不良预后相关，是患者预后的独立危险因素，提示miR-595具有抑癌基因功能，且与卵巢浆液性癌的发生、恶性进展及不良预后关系紧密，可作为卵巢浆液性癌的生物标志物，与Tian等[5]的研究结论一致；但有研究发现，miR-595高表达可导致白血病细胞的化疗耐药[14]、促进胶质细胞瘤的细胞增殖[15]，提示miR-595同时具有促癌基因、抑癌基因功能。笔者初步分析，miR-595作为转录后调控因子，与靶基因间存在一对多、多对一的复杂调控网络，且不同肿瘤细胞中，不同基因的表达丰度存在较大差异，进而导致miR-595可能同时具有促癌和抑癌功能，后续研究将深入探究miR-595在卵巢浆液性癌中的分子作用机制，以期从分子生物学水平阐述并支持本研究结论。ROC曲线结果显示，miR-203、miR-595对卵巢浆液性癌具有较好的预后预测价值，其灵敏度和特异度均在0.7以上，联合检测CA125、miR-203、miR-595，灵敏度和特异度显著提升，提示在卵巢浆液性癌的预后判断中CA125、miR-203、miR-595联合检测具有较好的临床应用价值。

综上所述，卵巢浆液性癌组织中miR-203高表达，miR-595低表达，两者均是患者不良预后的独立危险因素，具有作为卵巢浆液性癌生物标志物的潜能；检测miR-203、miR-595可能有助于卵巢浆液性癌患者的预后预测。