慢性乙型肝炎肝组织中T-bet的表达及临床病理意义

苟继周，李晓星，孙 炎，彭 程，张鸿英，赵 霞，孙宜康，罗伟仁，喻 宏

人类感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)会引起不同程度病变的肝脏疾病，有急性感染和慢性感染，而慢性感染有不同的临床表现，从轻度肝炎到肝硬化，最终发展成肝癌和终末期肝功能衰竭[1]。有关慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的发病机制研究表明，机体感染HBV后并不直接对肝细胞造成损伤，而是HBV在肝细胞内复制，引起机体的免疫应答损伤肝细胞所致[2]。感染HBV后引起的肝损伤免疫应答的细胞通路非常复杂，在影响机体免疫应答的众多因素中，CD4+辅助性T细胞发挥的应答对感染的预后有重要影响[2]。那么T-bet作为CD4+Th1型细胞的分化转录因子，在CHB免疫应答中发挥什么作用呢？已有研究通过RT-PCR检测外周血中CD4+辅助性T细胞的T-bet mRNA表达[3]。外周血研究并不能准确的反映肝组织内的实际情况[4]。目前，T-bet在CHB肝组织中的表达及与临床病理特征的关系尚未见相关报道。本实验采用免疫组化法检测T-bet在CHB肝组织中的表达，并对其在CHB发生、发展中的作用进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集深圳市第三人民医院(南方科技大学第二附属医院)2010年1月～2013年3月收治的62例CHB，其中男性47例，女性15例，年龄24～66岁，中位年龄(36.4±9.36)岁。所有患者HBsAg阳性，HBeAg或抗-HBe阳性，HBV DNA阳性或阴性，均经肝穿刺活检。诊断符合中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年)[5-6]，并对病理炎症分级进行分组，其中G1组23例，G2组19例，G3组12例，G4组8例；按纤维增生程度分组，其中S1组15例，S2组16例，S3组17例，S4组14例。所有患者均排除其他肝炎病毒重叠感染或酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和药物性肝炎等其他肝病。

1.2 主要试剂兔抗人T-bet(1∶100稀释)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人CD4单克隆抗体(即用型)和ChemMate EnVision检测试剂盒均购自Dako公司。

1.3 方法肝组织在彩超引导下通过弹射式组织活检枪方法取得，长约1.5 cm，取材后立即经10%中性福尔马林固定、常规脱水、浸蜡包埋，3 μm厚连续切片。依次行HE染色、天狼猩红染色。由两位经验丰富的病理医师采用双盲法独立在光镜下对肝组织病理变化进行评价，并对其炎症和纤维化进行分级分期。3 μm厚肝组织切片常规脱蜡至水，采用高压热修复抗原。滴加3%过氧化氢溶液室温孵育10 min(CD4使用0.3%过氧化氢)，滴加一抗4 ℃过夜。PBS冲洗后滴加二抗37 ℃孵育45 min。PBS冲洗后DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。以上操作步骤严格按试剂盒说明书进行。以PBS替代一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。所有切片采用同一批试剂完成。

1.4 结果判断T-bet表达定位于细胞核，CD4表达定位于细胞膜，均呈棕黄色为阳性。T-bet、CD4阳性细胞数判定标准：在高倍镜下对整条肝组织进行观察，然后对汇管区内阳性细胞进行计数，并统计分析。

2 结果

2.1 CHB肝组织中T-bet的表达在CHB肝组织中，T-bet呈散在或聚集分布(图1)；绝大部分T-bet分布在汇管区、界板、桥接坏死区和融合坏死区；小叶中有少量表达，但大多散在分布，也有一些灶性表达(图2)。

2.2 CHB不同分级分期中T-bet的表达G1级CHB肝组织中，汇管区有少量的T-bet阳性细胞(图3)；G2级CHB肝组织中，汇管区有中等量的T-bet阳性细胞(图4)，界面炎的肝细胞间也有少量T-bet阳性细胞；G3级CHB肝组织中，除汇管区有多量的T-bet阳性细胞外，桥接坏死区也有较多的T-bet阳性细胞(图5)；G4级CHB肝组织中，汇管区和融合坏死区可见大量的T-bet阳性细胞(图6)。随着CHB炎症逐渐加重，T-bet在肝组织内的阳性表达逐渐增多(r=0.869，P<0.01，表1)；同时，T-bet在CHB肝组织的表达随着纤维化程度加重而增多(r=0.423，P<0.01，表1)。

表1 CHB不同分级、分期中T-bet表达水平的比较

2.3 T-bet与CD4表达的相关性随着CHB病理分级分期的加重，CD4表达增多(表2)。T-bet在CHB肝组织的表达亦随着CD4阳性细胞数的增多而增多，两者呈显著正相关(r=0.938，P<0.01)。

表2 CHB不同分级分期中CD4表达水平的比较

3 讨论

T-bet最初从Th1 cDNA文库中分离得到，能与Th1特异的探针杂交，在向Th1细胞发育分化的早期T细胞中诱导T-bet表达。T-bet和GATA-3是Th1型细胞和Th2型细胞分化的主要调节因子。目前，T-bet与CHB的发病机制的关系尚不完全清楚，且大多是通过外周血标本来观察研究。本实验通过肝组织穿刺标本观察T-bet在肝脏中的表达，分析T-bet与CHB病变中炎症和纤维化的关系。该方法的特点是在组织原位直接观察T-bet在CHB病变组织中的分布，通过形态学可视化的方法阐述T-bet与CHB病变的关系。作者发现：在CHB肝组织中，T-bet呈散在或聚集分布，且绝大部分T-bet分布在汇管区、界板、桥接坏死区和融合坏死区；小叶中有少量表达，大多散在分布，也有一些灶性的表达方式。当机体感染HBV后与T-bet相关的免疫应答先在汇管区开始，而后随着病变的加重，逐步从界板炎到桥接坏死和融合坏死发展。这可能是由于CHB炎症活动初期，大量的HBV特异性T细胞首先浸润于汇管区，然后随着疾病的发展逐渐破坏界板，形成桥接坏死区和融合坏死区。

①②③④⑤⑥

本研究发现，T-bet在CHB肝组织中的表达随着CD4细胞数量的增多而增多，两者呈显著正相关。相关研究发现，在急性HBV感染中T-bet在CD8+T细胞中的表达水平增加，而长期慢性感染期间T-bet在CD8+T细胞中的表达丧失[7]。也就是说，CHB肝组织中表达T-bet的细胞可能以Th1型CD4+T淋巴细胞居多，因此T-bet表达随着CD4+细胞的增多而增多。当然，不可否认T-bet在众多免疫细胞中广泛表达[8]。

本实验发现，随着CHB炎症逐渐加重，T-bet在肝汇管区内的表达逐渐增多，而且随着病变程度加重，T-bet阳性细胞分布范围扩大。可能的机制:当机体感染HBV后，病毒作用于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等分泌细胞因子IL-12，IL-12诱导干扰素-γ(IFN-γ)产生，并促进Th0型细胞增殖分化成Th1型细胞，IFN-γ通过STAT1诱导T-bet表达，T-bet反过来又可诱导IFN-γ和IL-12Rβ2表达，形成正反馈调节环,协同促进Th1型细胞增殖[9-10]。

此外，T-bet激活除了与CD11a的表达增加有关外，还与促P-选择素和P-选择素糖蛋白配体1(PSGL1)糖基化结合酶的表达相关，该特性是T细胞黏附发炎内皮细胞和迁移到炎症部位的必要条件。同时，T-bet直接激活Th1型细胞特异性基因，包括一些细胞因子和趋化因子，迁移并招募其他免疫细胞到炎症部位，从而控制局部组织的感染[11]。本实验显示CHB中绝大部分T-bet阳性细胞分布在汇管区及坏死区的炎性病变区，说明T-bet阳性T细胞最先通过血液循环被运输到该区域，并发挥相应的免疫应答。

CHB的炎症分级和纤维化分期常同步发展，但也有不一致的情况。实验发现，T-bet在CHB肝组织的表达随着纤维化程度加重而增多，这可能是由于本实验纳入病例的炎症分级和纤维化分期同步发展而造成。

总之，本组通过免疫组化法检测T-bet表达与CHB炎症活动度、纤维化程度以及CD4细胞数呈正相关，提示其在CHB病变的发展以及免疫应答中发挥重要的作用。