结肠癌中HRH3表达对细胞增殖的影响

朱剑军，吴 昊

结肠癌的发病率和病死率均高居消化系统恶性肿瘤首位[1]。结肠癌的发生、发展是一个涉及多基因参与、多步骤的癌变过程。近年来，越来越多的文献报道组胺与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[2-3]。组胺能够显著增强乳腺癌细胞的放疗敏感性，提示组胺能够作为一种潜在的抗癌佐剂，提高肿瘤患者的放疗效果[2]。作为一种具有生理活性的小分子物质，组胺通过与组胺受体结合，传递信号，在不同类型细胞中发挥不用作用[2]。组胺激活组胺1型受体，促进细胞增殖、胚胎发育和肿瘤生长[4]。激活组胺1型受体和组胺4型受体活性能够显著增强乳腺癌细胞的放疗敏感性[2]，提示组胺受体蛋白家族可能是治疗恶性肿瘤的一组潜在作用靶点。组胺受体3(histamine receptor 3, HRH3)是一种7次跨膜蛋白，属于G蛋白偶联受体家族[5]。HRH3基因定位于染色体20q13.3，蛋白质由445个氨基酸组成，相对分子质量为48.6 KD。有研究报道HRH3与肝细胞肝癌、胆管细胞型肝癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的生长与转移有关[5-7]。但截至目前，关于HRH3在结肠癌生长过程中的作用尚未见相关报道。本实验采用转染siRNA片段的方式靶向沉默HRH3基因在结肠癌细胞中的表达，CCK-8和EdU法监测肿瘤细胞生长和增殖活性，qRT-PCR和Western blot法分析相关信号通路改变，明确HRH3基因在结肠癌细胞恶性增殖过程中的功能作用，探讨相关分子机制，从而为阐明结肠癌的发病机制提供理论基础，为结肠癌治疗提供潜在作用靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂DMEM培养液、胎牛血清(Hyclone公司，美国)，CCK-8(碧云天公司，中国)，EdU细胞增殖检测试剂盒(锐博公司，中国),Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent(Invitrogen，美国)，cDNA合成试剂盒、TB Green Advantage qPCR Premix(Takara公司，日本)，HRH3抗体、c-Myc抗体和CDKN1A抗体(Abcam公司，美国)，β-actin抗体、二抗(三鹰公司，中国)。

1.2 细胞培养常规培养结肠癌Ls174T细胞和SW480细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3 siRNA转染常规培养结肠癌细胞，将细胞接种于6孔板。24 h后，待细胞处于对数生长期时，进行细胞转染。转染步骤按照Lipofectamine 2000说明书进行。本课题实验分3组：空白对照组(只加Lipofectamine)、阴性对照组(si-NC组，转染阴性对照siRNA片段)、si-HRH3组(转染si-HRH3片段)。si-HRH3片段正义链序列5′-GGAGGAGAAAUGUGC ACUCAU-3′，反义链序列3′-CCUCCUCUUUACACGU GAGUA-5′。siRNA片段和阴性对照序列由上海吉码公司合成。

1.4 qRT-PCR常规培养结肠癌细胞，细胞转染siRNA片段48 h后进行实时荧光定量PCR实验。提取RNA、cDNA第一条链的合成步骤参照试剂盒说明书进行。采用TB Green qPCR Premix完成PCR扩增实验。扩增程序如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共计40个循环；最后72 ℃延伸10 min。溶解曲线条件按照常规程序进行。采用2-△△Ct算法计算目的基因的相对表达水平。HRH3引物、c-Myc引物和CDKN1A引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot常规培养结肠癌细胞，细胞转染siRNA片段72 h后进行 Western blot实验。RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。BCA试剂盒进行蛋白定量。后续按照常规步骤进行SDS-PAGE垂直电泳、转膜、封闭。常温封闭1 h后，一抗孵育过夜。TBST冲洗后，二抗常温孵育1 h。ECL发光液检测蛋白条带。HRH3和CDKN1A抗体工作浓度1∶1 000；c-Myc抗体工作浓度1∶2 000；二抗工作浓度1∶10 000。

1.6 CCK-8实验常规培养结肠癌细胞。转染siRNA片段6 h后将细胞接种于96孔细胞培养板。接种时间记为0 h。在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h这5个时间点检测细胞的生长状态。CCK-8溶液孵育1 h后，于酶标仪450 nm处检测。

1.7 EdU实验常规培养结肠癌细胞。转染siRNA片段48 h后进行EdU细胞增殖检测实验。加入适量EdU工作液，孵育2 h。后续经多聚甲醛固定、冲洗、EdU反应、Hoechst染色等步骤完成实验。最后用倒置荧光显微镜拍照。

2 结果

2.1 转染siRNA对结肠癌细胞中HRH3表达的影响采用转染siRNA片段的方法沉默HRH3基因表达。在结肠癌Ls174T和SW480细胞中，与阴性对照组相比，转染si-HRH3片段48 h后，si-HRH3组HRH3 mRNA表达水平降低，分别为82%±4.10%和75%±2.33%，差异均有统计学意义(P均<0.01，图1)。与空白对照组相比，阴性对照组HRH3 mRNA表达无显著变化(P>0.05)。Western blot结果进一步显示，与阴性对照组相比，转染si-HRH3片段72 h后，Ls174T和SW480细胞中HRH3蛋白水平均显著降低(图2)。上述研究表明，转染si-HRH3能够显著沉默结肠癌细胞中HRH3表达水平。

图1 转染si-HRH3对结肠癌细胞中HRH3 mRNA表达水平的影响：A.Ls174T细胞；B.SW480细胞；**P<0.01

图2 转染si-HRH3对HRH3蛋白表达水平的影响：**P<0.01

2.2 HRH3对结肠癌细胞生长的影响为研究HRH3表达对结肠癌细胞生长的影响，本实验首先通过CCK-8实验检测沉默HRH3后对结肠癌细胞生长的影响，结果显示，在Ls174T和SW480细胞中，与阴性对照组相比，转染si-HRH3片段后96 h，si-HRH3组细胞生长抑制率分别为39.00%±2.25%和35.54%±3.51%，其差异具有统计学意义(P均<0.01，图3)。沉默HRH3后，结肠癌Ls174T和SW480细胞的生长明显减慢。为进一步验证HRH3对结肠癌细胞增殖的影响，本实验采用EdU实验检测结果表明，在Ls174T细胞中，阴性对照组细胞的增殖率为52.68%±1.33%，si-HRH3组细胞增殖率为23.11%±0.89%，其差异具有统计学意义(P<0.01，图4)。在SW480细胞中，阴性对照组与si-HRH3组的细胞增殖率分别为53.69%±2.57%、17.14%±1.46%，差异有统计学意义(P<0.01，图4)。上述实验结果表明，沉默HRH3表达能够有效抑制结肠癌细胞的恶性生长。

图3 沉默HRH3对结肠癌细胞生长的影响：A.Ls174T细胞；B.SW480细胞；**P<0.01

2.3 沉默HRH3对细胞增殖关键分子表达水平的影响为深入研究沉默HRH3抑制结肠癌细胞增殖的具体分子作用机制，本实验采用qRT-PCR和Western blot法检测沉默HRH3后c-Myc和CDKN1A的表达水平。qRT-PCR实验结果发现，在Ls174T和SW480细胞中，与阴性对照组相比，si-HRH3组c-Myc mRNA表达水平均显著降低，分别为35.11%±1.52%和24.65%±1.80%，其差异均有统计学意义(P=0.025，P=0.030)；与阴性对照组相比，si-HRH3组CDKN1A mRNA表达水平显著升高，分别为56.73%±1.44%和55.39%±3.14%，其差异均具有统计学意义(P=0.0093，P=0.015，图5)。与qRT-PCR结果一致，Western blot实验结果显示，沉默HRH3后，c-Myc蛋白水平降低(P<0.01)，CDKN1A蛋白水平升高(P<0.01，图6)。上述研究结果表明，HRH3可能通过调控c-Myc和CDKN1A表达水平，影响结肠癌细胞的恶性增殖。

图4 沉默HRH3对结肠癌细胞增殖的影响：A.Ls174T细胞；B.SW480细胞

图5 沉默HRH3对c-Myc和CDKN1A mRNA表达的影响：A.Ls174T细胞中c-Myc mRNA的表达；B.SW480细胞中c-Myc mRNA的表达；C.Ls174T细胞中CDKN1A mRNA的表达；D.SW480细胞中CDKN1A mRNA的表达；*P<0.05，**P<0.01

图6 沉默HRH3对c-Myc和CDKN1A蛋白水平的影响**P<0.01

3 讨论

结肠癌是一种常见的消化系统肿瘤，2018年全球新增结肠癌109万余例，新增死亡55万余例，其发病率居所有恶性肿瘤第三位，病死率高居所有恶性肿瘤第二位[1]。肿瘤的发生、发展与肿瘤微环境密切相关[8]。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞和其它非细胞成分(包括细胞因子、趋化因子等生理活性物质)共同组成[8]。组胺作为肿瘤环境中的重要一员，由组氨酸脱氢酶催化L-组氨酸脱羧形成，主要储存于肥大细胞和嗜碱性粒细胞[3]。近年来，越来越多的研究证实，组胺和组胺受体在炎症和恶性肿瘤形成过程中发挥重要作用[9]。

HRH3表达异常与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[5,7]。Lin等[7]报道HRH3在恶性胶质瘤中呈高表达，抑制HRH3能够显著抑制恶性胶质瘤细胞生长、侵袭和上皮-间质转化。Chen等[6]研究发现，抑制HRH3后前列腺癌的生长能力和侵袭活性减弱，细胞凋亡增加。本课题组前期研究发现，HRH3在肝细胞肝癌中呈显著高表达，且激活HRH3后，肝癌细胞的增殖和迁移能力显著升高[5]。与上述报道一致，本实验通过转染siRNA片段沉默HRH3表达发现，沉默HRH3后结肠癌细胞生长减慢，细胞增殖活性显著降低，提示HRH3在结肠癌的发生进展过程中发挥促癌作用。然而，Francis等[10]在胆管细胞型肝癌细胞中发现，HRH3激动剂能够显著抑制肝癌细胞生长，提示HRH3在胆管细胞型肝癌细胞中发挥抑癌作用。基于此，作者推测HRH3在不同类型恶性肿瘤的发生进展过程中发挥不同作用，其作用机制有待深入研究。

目前，HRH3促进恶性肿瘤增殖和迁移的作用机制尚未完全阐明。Lin等[7]在神经胶质瘤中发现，HRH3通过调控PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路，影响上皮-间质转化关键分子的表达，如E-cadherin、ZO-1、vimentin和N-cadherin等，进而促进恶性胶质瘤细胞的侵袭转移。Francis等[10]报道，HRH3通过调控PKCα依赖的ERK1/2去磷酸化抑制胆管细胞型肝癌细胞生长，提示ERK信号通路参与HRH3介导的胆管细胞型肝癌细胞生长。PI3K/Akt、MEK/ERK等信号通路通过激活下游靶基因，如c-Myc、CDKN1A等，在促进细胞生存和细胞周期进展方面发挥重要作用[11-14]。c-Myc在多种恶性肿瘤中异常高表达，且c-Myc表达水平与肿瘤细胞恶性增殖活性密切相关[15]。本实验通过qRT-PCR和Western blot实验检测沉默HRH3后c-Myc的表达水平，结果显示，沉默HRH3后，c-Myc mRNA和蛋白水平均显著降低，提示HRH3可能通过激活c-Myc信号通路，促进结肠癌细胞恶性生长。

细胞周期失调是导致肿瘤细胞恶性增殖的一个重要始动因素[16]。Bai等[11]报道Akt通过调控CDK抑制因子CDKN1A，促进肿瘤细胞生存。本实验发现，沉默HRH3后，CDKN1A mRNA和蛋白水平均显著升高，提示HRH3可能通过调控CDKN1A表达水平，导致细胞周期紊乱，最终促进结肠癌细胞恶性增殖。然而，HRH3也能通过调控其它信号途径影响肿瘤细胞生存[6]。例如，Chen等[6]在前列腺癌细胞中研究发现，敲除HRH3后，雄激素受体(androgen receptor, AR)表达水平降低，提示HRH3可能通过AR途径抑制前列腺癌细胞生长、侵袭，促进细胞凋亡。上述研究结果提示HRH3可能通过激活不同信号通路，促进恶性肿瘤的发生、进展。

综上所述，沉默HRH3表达后，结肠癌细胞的增殖活性减弱，c-Myc表达降低，CDKN1A表达升高。基于此，推测HRH3可能通过调控c-Myc和CDKN1A转录表达，促进结肠癌细胞恶性增殖。但是，HRH3是如何调控c-Myc和CDKN1A表达，PI3K/Akt、MAPK/ERK等信号途径在HRH3介导的结肠癌细胞增殖过程中发挥怎样的作用，这些问题有待进一步深入探讨。