窖泥中高产己酸功能菌的分离筛选及代谢功能的研究

张 敏，郭 敬，杨玉珍，李 擎，任国军

（内蒙古河套酒业集团股份有限公司技术中心，内蒙古巴彦淖尔 015400）

窖泥是浓香型白酒酿造的基础，是酿酒功能菌繁衍栖息的场所[1]。浓香型酒功能菌区系是一个复杂的微生物群体。现代科学技术的发展揭示窖泥微生物的主体功能菌——厌氧梭状芽孢杆菌，栖息于窖内，它们根据自身特点，吸收糟醅体系中的营养物质，生长繁殖并进行新陈代谢，使简单的物质进行复杂的生化合成[2]。尤其以己酸功能菌为主的微生物生长繁殖、代谢、相互协调，形成了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒的典型风格[3]。

本试验目的在于找到浓香型白酒窖泥中高产己酸的功能菌株，并对其进行代谢功能的研究，以提高窖泥的生香功能及浓香型白酒中己酸乙酯的含量。本试验对于稳定公司窖泥质量具有重要意义，为浓香型白酒生产提供扎实的理论依据，同时善改良酒质提供微生物资源。

试验研究主要分为两个方面：一是从本厂原酒车间老窖泥（窖底泥、窖壁泥）进行富集培养、分离、筛选、复配试验，筛选到健壮、活力强、高产己酸的菌种。二是对筛选得到的菌种进行产酸性能研究、代谢产物生化性能鉴定以及菌种稳定性试验，优选得到适合本地区土壤、水质、气候环境的优良菌种，运用于窖泥车间和原酒车间。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 样品来源

从本厂原酒车间8 个浓香型大曲酒发酵池中分别取窖底泥和窖壁泥。

1.1.2 仪器设备

岛津GC-8A 气相色谱仪、强极性定制填充柱（1/8′×2M）、生物安全柜、干燥箱、恒温培养箱、立式高压灭菌锅、电子分析天平、显微镜、YQX 型厌氧培养箱、酸度计、恒温水浴锅等。

1.1.3 培养基

（1）富集及培养用培养基：乙酸钠0.5 %，硫酸铵0.05%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，酵母浸粉0.4%，无水乙醇2%，碳酸钙1%（无水乙醇和碳酸钙接种时加入），pH值自然。

（2）分离培养基（固体巴氏培养基）：乙酸钠0.5 %，硫酸铵0.05 %，磷酸氢二钾0.04 %，硫酸镁0.02 %，酵母浸粉0.4 %，琼脂2 %，无水乙醇2 %（灭菌后使用前加入），pH值自然。

以上培养基均在121 ℃下灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 高产己酸功能菌的分离纯化

1.2.1.1 富集培养（菌种热处理）

高产己酸功能菌的分离基质为车间窖底泥和窖壁泥；取不同班组不同窖龄窖壁泥和窖底泥（选取感官较好，酒样己酸乙酯含量较高的窖泥），各称取窖泥33 g，放入装有少量液体巴氏培养基的250 mL三角瓶中，采用水浴锅热处理的方法，在85 ℃水浴锅中热处理6～8 min，冷却至30～40 ℃，在无菌条件下继续添加液体巴氏培养基至三角瓶口部，再加2～3滴无水乙醇封口，34 ℃兼性厌氧培养10～15 d（产气结束）。然后，挑选出产气较早、较多的三角瓶，放入85 ℃水浴锅中热处理6～8 min（己酸菌孢子具有耐热性，采用热处理可杀死杂菌及己酸菌繁殖体，纯化菌种，同时激活己酸菌种，促进其迅速繁殖，从而得到纯化菌种的目的），冷却后以15 %的接种量接种于事先备好的装有新鲜液体巴氏培养基的三角瓶中，添满三角瓶，并封口，34 ℃兼性厌氧培养7～10 d，按此方法连续传代3次。

1.2.1.2 初筛（平板分离）

根据培养液的检测结果，选取己酸含量较高的富集培养液进行平板分离。选用常规梯度稀释、平板倾注分离的方法以及产酸菌分离方法（透明圈法和变色圈法）。常规梯度稀释、平板倾注分离的方法：将选取的富集培养液进行10 倍梯度稀释，从合适稀释度（10-3～10-8）的稀释液中分别吸取0.5 mL加入空皿中，每一稀释度做2 个平皿，放于厌氧包和厌氧盒中，于34 ℃严格厌氧培养5～7 d。

1.2.1.3 复筛（试管和三角瓶液体培养）

观察平板分离得到的单菌落，并挑选出生长良好的单菌落，按不同菌落形态，将选取的单菌落挑到盛有8 mL 已灭菌的液体培养基试管中，34 ℃恒温兼性厌氧培养或严格厌氧培养7～10 d。观察产气情况，选取产气较早、较多的试管转接于盛有30 mL已灭菌的液体培养基试管中，34 ℃恒温兼性厌氧培养7～10 d，然后对其发酵液进行理化指标的检测及分析，选取产己酸能力较高的菌株。将产己酸能力高的菌株传代转接于100 mL三角瓶及500 mL三角瓶，观察其发酵情况、菌种生长情况及检测其他指标。将产己酸菌较高的培养液制片，显微镜观察菌种的生长情况及特点，并传代观察其稳定性。选取初筛菌株进行己酸含量、代谢产物的测定，筛选到健壮、活力强、高产己酸的功能菌种。

1.2.2 代谢产物分析方法

1.2.2.1 硫酸铜显色法（定量）

吸取4 mL 培养液于试管中，再加入4 mL 的2 %硫酸铜和2 mL 无水乙醚，混匀后静置分层，如果乙醚层呈现蓝色则说明有己酸产生。

1.2.2.2 气相色谱法（定量定性）

样品处理：取发酵培养液1 mL 加入0.1 mL 盐酸酸化后，振荡器振摇，然后用50%的乙醇溶液定容至10 mL，振荡器振摇后吸取上清液，用0.2 μm滤膜过滤，上气相色谱检测乙酸、丙酸、丁酸和己酸。

气相色谱仪条件为：总压力4.0 kg/cm2，色谱柱压力：1.0 kg/cm2，进样口温度：190 ℃，检测器温度：190 ℃，柱箱温度：170 ℃，空气压力0.5 kg/cm2，氢气压力0.8 kg/cm2。进样量1.0 μL。

采用外标法，配制200 mg/100 mL 乙酸、丙酸、丁酸和己酸混标，配制成10 mL，用50 %乙醇溶液定容，待用。

1.2.3 微生物计数方法

采用血球计数板法计数以及观察菌种生长情况。

1.2.4 高产己酸功能菌培养条件优化及产酸特性的研究

1.2.4.1 培养温度对高产己酸功能菌的影响

培养基初始pH6.93，按15 %的接种量接入高产己酸功能菌种子液，用250 mL 三角瓶兼性厌氧培养，在不同的温度（28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃和40 ℃）条件下分别培养8 d、16 d 和33 d 取样，测定代谢产物，研究不同温度对高产己酸功能菌产酸能力的影响，同时在培养33 d 时检测最终pH值。

1.2.4.2 初始pH值对高产己酸功能菌的影响

使用盐酸和氢氧化钠调整培养液的初始pH值，分别调pH 值至3.35、4.07、4.53、5.05、5.57、6.00、6.53、6.93、7.49、7.95 和8.47，接种后置于34 ℃培养箱中兼性厌氧培养，不同的pH 值下分别培养8 d、16 d 和33 d 取样，测定代谢产物，研究不同初始pH值对高产己酸功能菌产酸能力的影响。

1.2.4.3 兼性厌氧与严格厌氧对高产己酸功能菌的影响

采用100 mL 三角瓶，三角瓶液体装满，15%接种量接入高产己酸功能菌种子液，分别置于普通培养箱兼性厌氧培养和厌氧培养箱中严格厌氧培养，培养温度为34 ℃。每天跟踪检测代谢产物，跟踪到7 d，研究不同空气接触对己酸菌产酸能力的影响，并找出高产己酸功能菌在不同的培养条件下的代谢特点。

1.2.5 高产己酸功能菌在原酒车间应用试验

原酒车间对高产己酸功能菌的应用试验，主要采用淋窖的方法，发酵结束后取楂甲酒样和翻甲酒样，并与对照组不加高产己酸功能菌进行淋窖对比。

2 结果与分析

2.1 高产己酸功能菌的分离筛选结果

本研究经过富集培养、初筛和复筛，利用硫酸铜显色法初步检测己酸含量，筛到1 株稳定高产己酸的功能菌，命名为HJ31#，对HJ31#菌株产己酸量用气相色谱法进行检测，结果见表1。由表1 可知，HJ31#菌株的产己酸量为1394 mg/100 mL、1340 mg/100 mL、1266 mg/100 mL、1040 mg/100 mL和1262 mg/100 mL，平均值为1260 mg/100 mL。

表1 HJ31#菌株产己酸量的检测

2.2 高产己酸功能菌HJ31#的菌落形态

高产己酸功能菌HJ31#分离基质——老窖泥感官评定为：黄褐色，有老窖泥气味和酯香酒香，无其他异杂味，香味较持久。经过菌落形态及革兰氏染色观察，HJ31#菌株革兰氏染色观察多数属革兰氏阴性菌，镜检初步确定己酸菌的菌体活跃健壮，营养细胞呈杆状，芽孢囊膨大，呈梭状。菌落呈黄色圆形，边缘规则，扁平。

2.3 高产己酸功能菌HJ31#培养条件及产酸特性研究结果

通过对高产己酸功能菌HJ31#不同培养温度不同时间、不同初始pH 值不同时间、兼性厌氧与严格厌氧不同培养时间条件进行优化，经气相色谱法检测4 种酸类物质含量的变化，从而分析高产己酸功能菌HJ31#代谢产物变化规律。

2.3.1 培养温度对HJ31#菌种的影响

HJ31#菌种不同培养温度8 d、16 d 和33 d 分别取样跟踪检测代谢产物，同时检测不同培养温度对HJ31#菌种最终pH 值的影响，检测结果见图1—图4。

从以上检测HJ31#菌种不同培养温度、不同时间代谢产物结果看：①HJ31#菌种在培养8 d 时，36 ℃培养己酸含量最高，在培养16 d 时，34 ℃培养己酸含量最高，培养33 d 时，36 ℃培养己酸含量最高，由此可知，HJ31#菌种最佳培养温度为34～36 ℃，在此温度条件下，HJ31#菌种活性最大，有最高的产己酸能力；②乙酸和丁酸含量在温度条件不合适的情况下，对产己酸有一定的影响，乙酸和丁酸在转化己酸时不够彻底，丙酸含量较低，不做分析；③在不同温度下，HJ31#菌种随着培养时间的延长，己酸含量也略有上升。HJ31#菌种在不同温度培养下，33 d 时检测pH 值，没有很大变化，都在6.0以上。

2.3.2 初始pH值对HJ31#菌种的影响

HJ31#菌种不同初始pH 值培养8 d、16 d 和33 d分别取样跟踪检测代谢产物，检测结果见图5—图7。

从以上检测HJ31#菌种不同初始pH 值、不同培养时间代谢产物结果看：①HJ31#菌种在培养8 d，初始pH 值在6.00 时，己酸含量最高，培养16 d，初始pH 值在7.95 时，己酸含量最高，培养33 d，初始pH 值在6.93 时，己酸含量最高，由此可知，HJ31#菌种最佳初始pH 值为6.00～7.95，在此初始pH 值条件下，HJ31#菌种活性最大，有最高的产己酸能力；②乙酸含量和丁酸含量在培养8 d 时，如果初始pH值不适宜，转化己酸的能力就差。随着时间的延长，乙酸和丁酸向己酸转化会越来越彻底，但是不如初始pH 值范围内转化己酸能力强。丙酸含量较低，不做分析。

对高产己酸功能菌的产酸特性进行研究发现，HJ31#菌种的最佳培养温度为34～36 ℃，最佳初始pH 值为6.00～7.95。该菌株在此温度和初始pH 值条件下，菌种活性最大，有最高的产己酸能力。

2.3.3 兼性厌氧与严格厌氧对HJ31#菌种的影响

HJ31#菌种兼性厌氧与严格厌氧培养代谢产物1～7 d跟踪检测数据，见图8、图9。

从图8 跟踪检测HJ31#菌种兼性厌氧培养7 d代谢产物结果分析：乙酸呈先升高后降低的趋势。丁酸呈先降低，随后升高，最后降低的趋势，最高值出现在第4 天，为135 mg/100 mL。己酸在前4 天缓慢上升，到第5 天时急剧上升，第7 天时达到最高，为989 mg/100 mL。因丙酸含量较低，不做分析。

从图9 跟踪检测HJ31#菌种严格厌氧培养7 d代谢产物结果分析：乙酸呈先升高后降低的趋势。丁酸呈先降低，随后升高，最后降低的趋势，最高值出现在第3 天为144 mg/100 mL。己酸在前3 天缓慢上升，到第4 天时急剧上升，第6 天时达到最高，为1269 mg/100 mL。丙酸含量较低，不做分析。

分析不同氧气接触水平对HJ31#菌种的影响：HJ 31#菌种兼性厌氧和严格厌氧培养乙酸和丁酸变化趋势一致，己酸在严格厌氧条件下第4 天时急剧上升，比兼性厌氧培养大量生成己酸要提前1 天，而且在严格厌氧条件下，己酸含量比兼性厌氧条件高，最高为1269 mg/100 mL。己酸量与菌种生长旺盛程度成正比。

同时跟踪检测HJ31#菌种的pH 值，当pH 值在6.0～7.0 之间时，HJ31#菌种的产己酸量均达到1000 mg/100 mL 以上，镜检菌种总菌数较多，健壮中杆菌多，活力较好。

2.4 高产己酸功能菌HJ31#原酒车间应用结果

原酒车间对HJ31#菌种的应用试验，采用淋窖的方法，结果见图10。

分析：从楂甲和翻甲酒样检测指标看，使用HJ31#菌种淋窖后，对产己酸乙酯量有所提升，但是效果不显著。

3 结论

通过多次对原酒车间老窖泥菌种进行分离筛选，从窖底泥中筛选得到菌体健壮、活力较好、己酸产量高、复合香气浓郁，遗传性状较稳定的菌株。革兰氏染色观察分离筛选得到的菌，多数属革兰氏阴性菌，并将其命名为HJ31#。

通过对产酸特性的研究，窖泥分离筛选高产己酸功能菌HJ31#菌株的最佳培养温度为34～36 ℃，最佳初始pH 值为6.00～7.95。HJ31#菌株兼氧、厌氧培养对菌种在代谢产物转化方面会存在一定的影响，在兼氧、厌氧培养时，乙酸、丁酸和己酸的变化规律较一致，HJ31#菌株在厌氧培养条件下产己酸含量比兼氧条件下要高，HJ31#菌株在厌氧条件下，最高产己酸量为1269 mg/100 mL。己酸量与菌种生长旺盛程度成正比。