饮用酒和食用酒精暴露诱导小鼠肝脏组织的损伤效应

魏梦娇，姚高毅，郭 琳

（1.山西大学环境与资源学院环境与健康研究中心，山西太原 030006；2.山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西汾阳 032205）

随着我国嗜酒人数的逐年增加，酒精性肝病也呈现出明显的上升趋势，成为仅次于甲肝乙肝等病毒性肝病的第二大肝脏疾病[1]。据估计，每年因滥用酒精死亡的人数大约有250 万人，其中大部分人死于酒精性肝病（ALD）[2]。作为酒精的主要代谢器官，肝脏的毒性作用相较于其他脏器更为明显。脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌，都是典型的酒精性肝病[3]。有文献表明，几乎所有长期暴露于酒精的个体都会发展为脂肪肝，约有25 %会发展成为肝硬化[4-5]。

已有的实验研究表明，食用酒精会引起啮齿类动物肝脏损伤[6-8]。如刘畅等[9]实验证明,食用酒精可以诱导小鼠肝脏质量和肝脏指数上升以及炎性细胞浸润等肝脏损伤；董金材等[10]证明，食用酒精也会引起小鼠肝细胞氧化应激和脂质过氧化；管文婕等[11]证明，食用酒精可诱导肝脏脂肪变性及肝纤维化。然而关于比较饮用酒和食用酒精诱导小鼠肝脏组织损伤的分子机制研究却鲜有报道。本实验借助小鼠灌胃模型，在氧化应激、自噬效应和细胞凋亡等方面来比较饮用酒和食用酒精暴露对小鼠肝脏组织的毒性效应，探究可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试验样：市售42%vol 饮用酒。42.0%vol 食用酒精。

实验动物：SPF 级雄性的C57BL/6J 小鼠30 只，体重（20±2）g，从北京维通利华实验动物技术有限公司购入。

试剂及耗材：SDS-PAGE 电泳及相关蛋白裂解液试剂均购自Amresco 公司；牛血清蛋白（BSA）购自Invitrogen 公司；考马斯亮蓝（G-250）购自Sigma 公司；一抗β-actin 购自Cell Signaling Technology 公司，二抗Bcl-2，Bax，P53，Beclin-1，LC3B 均购自北京博奥森公司；ROS 检测试剂盒（Item Number S0033）购自碧云天公司；MDA、SOD 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

仪器设备：高速低温离心机、低温冰箱及多功能酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；凝胶成像系统和垂直电泳槽，美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理

30 只雄性的C57BL/6J 小鼠随机分为3 组：对照组、饮用酒处理组和食用酒精处理组，每组10只。将小鼠饲养在温度为（24±2）℃、相对湿度50%～55%的房间中，光照、黑暗周期为12 h，动物适应性喂养1 周，随意饮用自来水。通过灌胃[12]分别一次性灌服0.5 mL 的蒸馏水，饮用酒样以及42.0%vol 的食用酒精。每周一次，连续灌服5 周后处死小鼠，迅速解剖取小鼠的肝脏组织，放于液氮中快速冰冻，随后转至-80 ℃下储存备用。

1.2.2 Western Blot分析

取30 mg 肝脏组织样品，加入500 μL 裂解液，在匀浆机上进行充分匀浆。匀浆完成后冰上孵育20 min。然后在13000 r/min，4 ℃的条件下对样品离心15 min，离心完成后取上清液，用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度。将其进行等量分装，于-20 ℃保存备用。取60 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用质量分数为3%的牛血清蛋白（BSA）封闭1 h后，加入一定比例一抗（β-actin：1∶1000，Bax、Bcl-2、P53、LC3B、Beclin-1：1∶500），在4 ℃条件下摇床孵育过夜。用PBS 洗膜3 次，每次10 min，结束后用荧光标记的第二抗体（1∶5000）孵育2 h，孵育完成后，清洗二抗。用LI-COR Odyssey 近红外双色激光成像系统扫膜分析，并用IPwin32 软件处理分析目标条带的光密度值。最终结果用目的蛋白与βactin的光密度比值来表示。

1.2.3 活性氧及其相关酶的测定

取小鼠肝脏组织样品25 mg，加入500 μL 0.1 M PBS 缓冲液，充分匀浆。在4 ℃，1000 G 的条件下离心10 min，取上清液。照试剂盒说明测定不同组小鼠肝脏组织ROS活性及MDA、SOD的含量。

1.3 数据分析方法

数据以均值±标准误（mean 值法组）的形式表示。采用origin2017对数据进行统计分析作图。用单因素方差分析法（One-way ANOVA法）检验饮用酒组、食用酒精组与对照组及饮用酒组与食用酒精组差异显著性（与对照组相比：* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001；与饮用酒组相比：#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001）。

2 结果与分析

2.1 饮用酒和食用酒精暴露对小鼠肝组织氧化应激反应的影响（图1）

由图1 可以看出，饮用酒和食用酒精暴露后，小鼠肝脏组织中的ROS 活性显著增加，分别为对照组的3.76 倍、5.15 倍（p＜0.001，p＜0.001）；与此同时，小鼠肝脏组织中促氧化因子和抗氧化因子的表达发生相应的变化，其中过氧化氢酶MDA 的水平上升，分别为对照组的2.21 倍、2.73 倍（p＜0.01，p＜0.01），超氧化物歧化酶SOD 水平明显降低，分别为对照组的0.82 倍、0.42 倍（p＜0.05，p＜0.01）。除此之外，与饮用酒处理组相比，食用酒精处理组肝脏氧化应激效应更为明显，呈现出统计学差异（p＜0.05）。

2.2 饮用酒和食用酒精暴露对小鼠肝组织自噬相关蛋白表达的影响（图2）

由图2 可以看出，与对照组相比，饮用酒组和食用酒精组的自噬相关因子的表达呈上升趋势。其中自噬标志因子LC3B 的表达分别增加为对照组的1.42 倍、1.79 倍，Beclin-1 的表达增加分别为对照组的1.43 倍、1.78 倍，说明乙醇能够诱导小鼠肝脏体内细胞自噬水平上升；食用酒精组的LC3B和Beclin-1 表达增加更为明显，具有统计学意义（p＜0.05），表明其诱导的肝细胞自噬程度较饮用酒组大。

2.3 饮用酒和食用酒精暴露对小鼠肝组织凋亡相关蛋白表达的影响（图3）

由图3A、图3B、图3C 可知，饮用酒和食用酒精灌胃处理小鼠后，Bax 的表达分别上调为对照组的1.28 倍、1.31 倍，Bcl-2 的表达分别下降为对照组的0.58 倍、0.43 倍（p＜0.05，p＜0.01），Bax/Bcl-2 的比值具有显著性差异，分别为对照组的2.24 倍、3.03倍（p＜0.05，p＜0.01）；由图3D 可以看出，饮用酒组和食用酒精组的P53 表达分别升高为对照组的1.51 倍、1.88 倍（p＜0.05，p＜0.01）；食用酒精组与饮用酒组相比，Bax/Bcl-2 的比值以及P53 的表达增加更为明显，具有显著性差异（p＜0.05）。

3 讨论与结论

乙醇诱导机体损伤的机制复杂多样，主要有代谢产物乙醛的毒性效应、氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、细胞凋亡、自噬及内毒素等。有相关研究表明，氧化应激在酒精性肝损伤的发展中起着重要作用[13-14]。乙醇进入小鼠体内，诱导肝脏中代谢乙醇的主要酶——CYP2E1 的活性增加，从而导致大量的ROS 产生[15]，细胞呈现氧化应激状态。活性氧（ROS）的产生和积累，不断耗竭SOD 等抗氧化因子，对抗氧化系统产生抑制效果，促使氧化因子（如MDA）的大量积累，导致促氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调，产生了大量受损的线粒体致使肝细胞凋亡或死亡[16-17]，导致肝功能受损。

自噬发生过程中有由两个类泛素共轭系统介导，分别是Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统，作用于自噬囊泡膜的进一步延长。自噬发生时，Atg16和Atg12-Atg5结合，使LC3转化为脂共轭膜结合型LC3B，直到自噬溶酶体形成[18-19]。迄今为止，在完整的自噬小体上只发现了LC3，故而被广泛地作为研究自噬的标志分子，因此LC3B 水平升高通常表明自噬小体的聚集[20-21]。Beclin-1 是酵母自噬基因6 在哺乳动物的同源物，它可与抗凋亡因子Bcl-2 相互作用，参与自噬和调亡的启动过程，对细胞生存和死亡具有重要意义[22-23]。自噬被认为是众多细胞的生存调节因素，适度的自噬作为保护可以清除多余的代谢蛋白，但自噬不足或过强时，则会导致组织细胞死亡。本研究表明，乙醇暴露促使肝细胞体内的LC3B 及Beclin-1 的表达增加，说明在乙醇的诱导下，大量受损的线粒体和ROS自由基产生，自噬反应被激活，产生大量自噬小体和溶酶体，消化降解体内细胞，引起肝细胞死亡。

Bcl-2 家族相关基因的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一[24]，Bcl-2 和Bax 分别作为Bcl-2 家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝细胞凋亡的基因调控中起着中心作用[25]。P53 基因作为细胞周期G1 期DNA 损伤的检查点，在正常情况下具有阻断细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用[26]。研究结果表明，饮用酒和食用酒精处理小鼠后，抑癌基因P53 的表达增加，同时上调促凋亡基因Bax的转录，抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表达，Bax/Bcl-2的比值具有显著性差异。乙醇暴露情况诱导下细胞凋亡增多，虽然其在一定程度上利于调节肝功能，但当细胞凋亡增加所致肝脏损伤超过其代偿能力时，会导致肝脏结构和功能的异常，甚至导致各种肝脏疾病。

研究结果表明，由于亲肝性毒物乙醇的暴露，诱导小鼠肝脏组织氧化应激的发生，促进细胞发生自噬，进而诱导细胞凋亡，导致饮用酒组和食用酒精组都表现出明显的肝损伤；值得注意的是，在相同酒精度数情况下，食用酒精暴露诱导的肝脏损伤程度更大，且具有明显的统计学差异，提示饮用酒在酿制过程中产生的某些组分可能对酒精性肝损伤起到一定的保护作用，其机理还需要进一步研究确定[27-29]。