ROP16 过表达对THP-1 诱导分化巨噬细胞极化的影响

杨宁爱， 苏雅静， 贾 伟，3， 杨 红， 康 佳， 周云花，刘学雷， 康宇婷， 赵志军，3

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学临床病原微生物重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）简称为弓形虫，是引起全球寄生虫病的人畜共患寄生虫之一，可以感染包括人在内的所有温血动物[1]。弓形虫作为全球重要的人兽共患寄生虫，具有用于研究宿主（或细胞）和寄生虫相互作用关系的生物学特性。棒状体是弓形虫顶端复合体上的一种分泌细胞器，能够在弓形虫感染宿主时迅速分泌蛋白质到宿主细胞内而发挥生物学功能。弓形虫棒状体蛋白16（ROP16）作为弓形虫棒状体蛋白家族中重要的毒力因子之一，具有核定位的结构[2]，能在弓形虫感染宿主过程中迅速进入宿主细胞核内。

巨噬细胞是感染免疫机制研究中重要的细胞类型[3]。直接使用原代巨噬细胞进行实验相比细胞系更接近生理状态，但是由于原代巨噬细胞获取难、个体差异大、操作繁琐和离体存活时间短等原因，选择可稳定传代大鼠或者小鼠巨噬细胞系或者诱导单核细胞为巨噬细胞仍是现阶段实验研究中巨噬细胞的主要来源。常使用大鼠或者小鼠巨噬细胞研究弓形虫感染和ROPs 家族蛋白作用机制，本文使用佛波脂诱导人外周血单核细胞（THP-1）分化为巨噬细胞作为人巨噬细胞模型[4-5]来探讨ROP16 对THP-1 源性巨噬细胞的极化影响。因THP-1 经佛波脂诱导分化后会由悬浮状态变成不增殖的贴壁状态，较难进行慢病毒的转染和稳定表达细胞株的筛选，所以本研究拟构建了弓形虫ROP16 过表达载体pCDHROP16，先转染THP-1 细胞，再使用佛波脂诱导THP-1 分化为巨噬细胞[6]进行相关实验研究，为进一步深入研究ROP16 在人体巨噬细胞内的表达奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

弓形虫ME49 虫株和pCDH-MSCV 载体为本实验室保存；THP-1 购于ATCC；人胚肾细胞株（HEK293T）由本实验室保存；pMAL、VsVg、pREV包装质粒为本实验室保存；大肠埃希菌DH5α 感受态细胞购于TIANGEN 公司；Trizol 试剂购于美国Invitrogen 公司；嘌呤霉素购于Thermo 公司；SYBR Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA 连接酶购于大连TaKaRa 生物工程公司；胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA、1640、DEME 培养液购于美国Gibco Inc 公司；兔抗人HIS-TAG 抗体购于CST 公司；兔抗人精氨酸酶-1（Arg-1）抗体、兔抗人诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体、HPR 标记山羊抗兔IgG（IgG-HRP）购自Proteintech 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮中取出THP-1 冻存细胞株后，于37 ℃水浴中快速融化。处理复苏细胞后，培养于37 ℃、5%CO2细胞培养箱，使用1640培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素）培养细胞，细胞传代三次后用于后续实验。同理使用DMEM 培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素）复苏传代HEK293T 细胞三代后备用。

1.2.2 THP-1 细胞的诱导 将THP-1 细胞接种于10 cm 培养皿内（细胞约4×106个/皿）。保持佛波脂的浓度为100 ng·mL-1。培养于37 ℃、5%CO2培养箱48 h 后诱导THP-1 细胞成为贴壁的巨噬细胞。

1.2.3 ME49 虫株速殖子总RNA 的提取 Trizol法提取ME49 虫株总RNA，测定总RNA 的纯度和浓度，用反转录试剂盒进行逆转录得到ME49虫株cDNA，进行后续实验。

1.2.4 重组质粒pCDH-MECV-ROP16 的构建及鉴定 根据GeneBank 中ROP16 基因全长编码序列设计含有his-tag 标签的引物，引物两端同时包含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点，上游序列：5’-GCGAATTCACCATGAAAGTGACCACGAAAG GGCTTGC-3，下游序列：5’-GATCAGCGGCCTACATCCGATGTAAAGAAAGTTCGGTAGTTG-3’。建立退火温度55 ℃、60 μL 的PCR 反应体系。将引物退火至4 ℃保存，使用EcoRⅠ、NotⅠ酶双酶切PCR 片段和pCDH-MSCV 空载体，使平末端变成黏性末端的DNA 双链，使用T4 连接酶室温过夜连接PCR 片段和载体；连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞后涂布于LB 平板上（含氨苄霉素），培养16 h 后挑取阳性菌落接种于LB液体培养基（含氨苄霉素）中摇菌扩增过夜，次日提取质粒；用EcoRⅠ、NotⅠ对获得质粒进行双酶切验证，验证结果正确则送公司测序。

1.2.5 pCDH-MSCV-ROP16 慢病毒的包装、浓缩纯化及滴度测定 培养293T 细胞，待细胞密度达到70%～80%时，将pCDH-MSCV-ROP16 质粒（10 μg）+包装质粒（pMAL 6.52 μg+VsVG 3.52 μg+pREV 2.52 μg）转染到293T 细胞中，同理将pCDH-MSCV 空载质粒10 μg+包装质粒（pMAL 6.52 μg+VsVG 3.52 μg+pREV 2.52 μg）转染到293T 细胞中，24 h 后更换培养基，转染后48 h和72 h 收 集 细 胞 上 清 液，3500 r·min-1离 心5min，弃去沉淀。用0.22 μm 滤膜对离心后的上清液进行过滤，30000 r·min-1，4 ℃离心2 h。弃上清，加入4 ℃预冷PBS，吹打重悬沉淀，6000 r·min-1离心5 min，用滤膜（0.22 μm）过滤后分装于新的EP 管中-80 ℃冰箱保存。随机选取样品感染细胞进行滴度检测。感染前一天将293T 细胞以1×105个细胞/孔接种到24 孔板中，梯度稀释待测样品，分别感染对应孔细胞，感染24 h 后补充或者更换培养基。感染72 h 后使用荧光显微镜检测病毒感染荧光表达情况，通过感染后的活细胞数量来计算病毒滴度，病毒滴度（TU·mL-1）=［活细胞数/病毒原液量（mL）］×稀释倍数。

1.2.6 ROP16 过表达稳定细胞株的筛选及THP-1 细胞诱导分化 使用1640 培养基（10%胎牛血清、1%青链霉素）培养THP-1 细胞。转染前，使细胞密度为5×104个/mL，6 孔板每孔细胞悬液为3 mL，设置ROP16 过表达（OE）组、空载体（EP）组和阴性对照（ZC）组，将pCDH-MSCV-ROP16 过表达病毒液、pCDH-空载体病毒液及1640 培养基各1 mL 加入6 孔板中，按照公式计算加入慢病毒体积（慢病毒体积=MOI×细胞数目/病毒滴度），在预实验中确定pCDH-ROP16 慢病毒为MOI 值60，pCDH-空载体慢病毒MOI 值为40，放于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养，感染12~16 h 后加入或更换新鲜培养基。感染后96 h 用荧光显微镜观察细胞荧光表达丰度情况。确定慢病毒转染成功后，用嘌呤霉素（浓度为2 μg·mL-1）的1640完全培养基传代培养，每2 d 对培养液进行更换，约5~7 d，至EP 组和OE 组细胞无死亡。扩大培养细胞，获取稳定表达ROP16 的THP-1 细胞株和pCDH 空载体THP-1 细胞株，液氮冻存备用。接种细胞数为4×106个/10 cm 培养皿内，保持培养液中佛波脂的浓度为100 ng·mL-1，培养48 h 后诱导悬浮THP-1 细胞变成贴壁的巨噬细胞。

1.2.7 RT-qPCR 实验检测ROP16 及相关因子mRNA 表达水平 收集ZC 组、EP 组和OE 组细胞密度80%~90%的细胞，Trizol 法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，通过RT-PCR 测定不同组细胞中ROP16、白细胞介素（IL）-1、IL-10、IL-12、Arg-1、转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、iNOS 等mRNA表达情况。通过Light Cycler 480 system PCR 仪软件检测结果，分析得到Ct 值，应用2-△△Ct值计算3 组细胞相关因子mRNA 相对表达量，△△Ct=（待检测样品目的基因Ct 均值-待检测样本内参基因Ct 均值）-（正常样本目的基因Ct 均值-正常样本内参基因Ct 均值）。实验所用引物见表1。将ZC 组细胞的mRNA 表达量设为1，所有实验均进行3 次重复。

1.2.8 Western blot 检测ROP16 及相关蛋白表达水平 收集细胞密度达80%~90%时的ZC 组、EP组和OE 组细胞。配制5%浓缩胶、10%分离胶，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，上样电泳、转膜、用5%脱脂牛奶室温封闭，加入一抗（1∶1000 稀释）4 ℃孵育，过夜，用HRP 标记的二抗（1∶5000 稀释）孵育，PBST 洗膜3 次，每次10 min。配制显色液（1∶1）曝光，分析条带灰度值。β-actin 作为内参。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pCDH-ROP16 过表达慢病毒载体的构建及鉴定

通过GeneBank 查询Toxoplasma gondi-ROP16基因序列设计PCR 引物，用PCR 扩增ROP16基因目的片段（2124 bp），将扩增产物使用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后T4 连接到载体pCDH 上，连接产物转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞培养过夜，次日挑取阳性菌落摇菌扩增过夜。将转化后的阳性克隆菌液提取质粒后，EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序（上海生工公司），测序结果经Blast 比对，发现成功连接目的基因ROP16 在质粒pCDH 上。构建成功的pCDHROP16 质粒进行慢病毒包装（图1）。

表1 引物序列

2.2 pCDH-MSCV 慢病毒滴度测定及转染THP-1 细胞稳定转染细胞株的建立

将慢病毒pMAL、VsVg 、pREV 三包装质粒系统及构建的慢病毒重组质粒pCDH-ROP16 和转染试剂一起加入293T 细胞中。转染48～72 h 后，可以看到80%以上的293T 细胞发出绿色荧光，证明慢病毒包装成功，显示该慢病毒转染效率较高（EP 组步骤同上）。慢病毒滴度是通过定量PCR实验检测慢病毒在细胞基因组中整合的拷贝数。得到OE 组滴度为3.27×108TU·mL-1，EP 组的滴度为7.54×108TU·mL-1。将包装成功的pCDHROP16 慢病毒和pCDH 空载对照慢病毒分别转染细胞。转染48 h 后荧光显微镜观察细胞GFP绿色荧光有表达，72 h 后观察到细胞绿色荧光表达明显增强，且细胞生长状态良好。此时使用含嘌呤霉素的1640 完全培养基进行细胞传代培养，待1～2 周后，使用荧光显微镜观察发现视野中95%以上细胞均发出绿色荧光，且细胞生长状态良好，几乎无死亡，则表明THP-1 稳定表达ROP16 细胞株及pCDH 空载细胞株建立成功（图2）。

2.3 佛波脂诱导分化悬浮THP-1 为贴壁巨噬细胞并验证ROP16 mRNA 及蛋白表达情况

使用倒置显微镜观察经100 ng PMA 诱导的THP-1 细胞由悬浮细胞变为贴壁细胞，证明诱导成功。OE 组细胞ROP16 mRNA 表达高于EP 组和ZC 组（P均<0.05），ZC 组与EP 组差异无统计学意义（P>0.05）（图3A）。Western blot 蛋白条带分析，OE 组ROP16 蛋白表达高于ZC 组和EP 组（图3B）。

2.4 相关因子蛋白表达水平的检测

提取ZC、EP 和OE 组细胞全蛋白，Western blot 检测iNOS、Arg-1 蛋白的表达情况。蛋白条带及灰度分析软件分析，OE 组细胞iNOS 蛋白表达高于ZC 组和EP 组（P均<0.05），ZC 组与EP组iNOS 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。OE 组细胞Arg-1 蛋白表达低于ZC 组和EP 组（P均<0.05），ZC 组与EP 组Arg-1 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。

2.5 相关因子mRNA 表达水平的检测

提取ZC、EP 和OE 组细胞总RNA 并逆转录获得cDNA 后进行RT- PCR 检测M1 型巨噬细胞相关因子iNOS、IL-1、IL-12、TNF-α mRNA 和M2 型巨噬细胞相关因子Arg-1、IL-10、TGF-β mRNA 相对表达量。结果显示，OE 组细胞M1 型巨噬细胞相关因子iNOS、IL-1、IL-12、TNF-α mRNA 表达均高于EP 组和ZC 组（P均<0.05），OE 组细胞M2 型巨噬细胞相关因子Arg-1、IL-10、TGF-β mRNA 表达均低于EP 组和ZC 组（P均<0.05）。RT-PCR 和Western blot 的结果趋势一致（图5）。

3 讨论

弓形虫是一种除红细胞以外可以寄生于所有真核生物细胞内的严格胞内寄生原虫，能够感染所有温血动物。隶属于顶腹门、孢子虫纲、真球虫目、等孢子球虫科、弓形虫属，是机会性致病原虫[7-8]。弓形虫ROP16基因位于VIIb 染色体上，编码707 个氨基酸，基因全长3014 bp，cDNA 全长2124 bp。ROP16 蛋白是弓形虫棒状体家族分泌的一类丝氨酸-苏氨酸激酶[9]，在弓形虫缓殖子期、速殖子期和子孢期都有分泌表达。在弓形虫感染宿主有核细胞时ROP16 蛋白被棒状体分泌释放到细胞质溶胶内，通过核易位序列迅速转移定位到宿主细胞核内并发挥功能。有研究发现[10]，在弓形虫入侵宿主细胞的过程中，在10 min 内，ROP16 即可被分泌进入宿主细胞核中，对弓形虫产生棒状体蛋白和弓形虫分裂增殖都发挥着一定的作用。有研究[11]对人体弓形虫感染淋巴结切片进行免疫组织化学分析，发现超过50%的淋巴结微粒肉瘤中的巨噬细胞是M1 型巨噬细胞，这也是第一份证明人弓形虫病中存在M1 型巨噬细胞的报告。目前关于ROP16基因过表达在THP-1 和THP-1 源性巨噬细胞中的研究报道极少，因此，本文对研究ROP16 调节人巨噬细胞极化和其在人巨噬细胞中作用机制有积极作用。

巨噬细胞在宿主感染免疫中起着重要的作用，巨噬细胞通常存在于两个不同的子集中，即经典激活的M1 巨噬细胞和/或活化激活的M2 巨噬细胞。M1 和M2 巨噬细胞具有不同的功能和转录谱，它们具有破坏病原体或修复炎症相关损伤的独特能力[3]。趋化因子系统的差异调节将极化巨噬细胞整合到对微生物病原体和肿瘤的抗性或促进途径，或免疫调节、组织修复和重塑中。当感染或炎症严重到足以影响器官时，巨噬细胞首先表现出M1 表型以释放针对刺激的TNF-α、IL-1β、IL-12 和IL-23。但如果M1 型阶段继续，它可能会导致组织损伤。所以为了抑制炎症的发生发展，机体中M2 型巨噬细胞会大量分泌IL-10和TGF-β，帮助机体组织修复、重塑，保持体内状态平衡。研究显示M1 型巨噬细胞对iNOS 高表达，并且可以分泌TNF-α、IL-12 等多种促炎性因子，使细胞产生促炎作用。M2 型巨噬细胞对Arg-1 高表达，分泌IL-10、TGF-β 等具有抗炎作用的因子，发挥抗感染的作用，促进组织细胞修复[12-13]。本实验构建弓形虫ROP16 过表达慢病毒载体，成功筛选稳定转染ROP16 过表达THP-1细胞株，诱导成为THP-1 源性巨噬细胞。RTPCR 结果显示，过表达ROP16 后，THP-1 源性巨噬细胞表达的iNOS、IL-1、IL-12、TNF-α 等M1型巨噬细胞相关因子mRNA 相对表达量增高，而Arg-1、TGF-β、IL-10 等M2 型巨噬细胞相关因子mRNA 相对表达量则降低。结合Western blot实验结果，过表达ROP16 后宿主细胞iNOS 蛋白表达量增高，Arg-1 蛋白表达量降低，说明THP-1 源性巨噬细胞在ROP16 蛋白的作用下使细胞向着M1 型方向偏移。

很多疾病中分泌的细胞因子可以影响THP-1的黏附和趋化性，进而促进巨噬细胞极化趋向于促炎表型发展。研究显示在妊娠过程中，弓形虫感染能够下调蜕膜巨噬细胞上的LILRB4，从而增强M1 激活功能。通过改变M1 和M2 膜分子减弱M2 耐受功能表达、精氨酸代谢酶的合成和细胞因子分泌谱[14]。Jensen 等[15]研究也表明，感染弓形虫I 型和III 型虫株的小鼠巨噬细胞被极化为M2 激活状态，而II 型感染的巨噬细胞类似于M1 激活的方向。主要由于弓形虫ROP16 作为激酶能激活STAT6 信号通路，而致密颗粒蛋白GRA15 能激活NF-κB 信号通路。该报告提供了可直接激活弓形虫感染的巨噬细胞的直接证据，并描述了独立于模式识别受体起作用以实现M1或M2 激活的寄生虫特异性因子，表明ROP16 对人源性巨噬细胞极化的研究是可行且有意义的。但由于THP-1 细胞诱导分化后细胞状态会由悬浮细胞变成不增殖的贴壁细胞，所以为了能够获得足够的细胞量和筛选得到稳定转染ROP16 的细胞，本研究采取先过表达THP-1 细胞，再使用佛波脂诱导THP-1 分化为人源巨噬细胞来进行研究。

在以往弓形虫及弓形虫ROP16 的研究中，多采用小鼠或者大鼠细胞模型进行研究。本研究选用THP-1 诱导分化巨噬细胞，对研究ROP16 早期干扰细胞极化具有重要意义，也为弓形虫ROP16对宿主细胞的致病机制研究提供一定基础。