玉米浆在阿维菌素发酵配方经济性优化中的应用

程 曦,刘进峰,刘丽虹,高亚琪

(1.河北兴柏农业科技有限公司 河北省阿维菌素生物技术重点实验室,河北 石家庄 051530; 2.石家庄市农业技术推广中心,河北 石家庄 050000)

玉米浆(Corn steep liquer,CSL)是湿磨法制备玉米淀粉的副产物,为廉价的有机氮源[1]。其富含的氨基酸、多肽及其他营养元素,在细菌发酵生产氨基酸、有机酸和维生素中均有成熟的应用[2-5];在霉菌发酵生产青霉素时有所应用[6];在放线菌发酵中,徐瑶等[7]研究了用玉米浆和0.5%硫酸铵替代酵母粉对阿维菌素合成的影响。这些应用方面的差异除了菌种特性不同,玉米浆在加工、储存和运输过程中质量波动也限制了其作为廉价有机氮源的推广应用[8]。

阿维菌素(Avermectins,AVMs)是阿维链霉菌在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中,通气搅拌深层发酵而得的杀虫杀螨剂。作为高效低毒的生物农药及医药中间体,正逐步取代其他农药在农业上的应用。阿维菌素发酵液中含有8种组分,B1组分,尤其是B1a组分杀虫效果最好,是商品化阿维菌素的主要组分[9-10]。自问世以来,随着菌种的改良、配方及控制工艺的优化,生产水平大幅提高,特别是随着现代生物技术的发展应用,中国科学院微生物研究所获得了与阿维菌素高产相关包括aveR在内的12个靶基因,并运用高通量筛选技术筛选高产菌株A56,使阿维菌素B1a发酵效价达到6.382 g/L[11]。近年来,工业化规模生产的发酵效价基本维持在6.3～6.5 g/L,进入平台期。为进一步降低生产成本,使用廉价的玉米浆部分替代黄豆饼粉,不但可以降低生产成本,还可以将玉米浆变废为宝。玉米浆中的蛋白主要以小分子氨基酸的形式存在,可作为速效的有机氮源;而黄豆饼粉中的蛋白只有被细胞水解后才能发挥作用,水解过程比较缓慢,细胞对蛋白的利用速度也比较慢,可作为缓效氮源,两者在功能上是有区别的;玉米浆和黄豆饼粉虽然都是氮源,但是均含有少量的糖类,部分替代后,还涉及碳、氮平衡问题。另外还应考虑玉米浆中可能存在的限制性物质对菌体生长或者产物合成的影响,所有这些均应在配方的优化设计中考虑。基于上述背景,笔者在摇瓶及100 L发酵罐上研究了玉米浆部分替代黄豆饼粉工艺,为工业化生产降低阿维菌素成本提供理论支持。

1 材料及方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

菌种来自于河北省阿维菌素生物技术重点实验室AVS-78。

1.1.2 50 L种子罐,100 L发酵罐

镇江东方生物工程设备技术公司产品,配备有补料、DO和pH等自动控制系统和具有数据采集及分析功能的软件系统。

1.1.3 仪 器

超净工作台(SW-CJ-2G)购于苏州净化设备有限公司,卧式恒温摇床(TS-211B)购于无锡玛瑞特科技有限公司,高效液相色谱仪(P-230)购于大连依利特分析仪器有限公司,电热恒温干燥箱(DHG-9023A)购于上海环竟试验设备厂。

1.1.4 玉 米 浆

玉米浆是河北兴柏生物科技有限公司产品,常规检验主要理化指标如下:

外观呈棕黄色,黏稠状,芳香气味。

氮质量浓度>40 g/L,还原糖质量浓度>20 g/L,溶磷质量分数<1%,pH为3.8～4.2。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 摇瓶种子培养基

质量浓度分别为玉米淀粉25 g/L,黄豆饼粉8 g/L,花生饼粉10 g/L,酵母膏4 g/L,酵母粉5 g/L,氯化钴10 mg/L。

培养条件:摇床转速220 r/min,温度28～29 ℃,时间45～50 h。

1.2.2 50 L种子罐培养基

质量浓度分别为淀粉20 g/L,黄豆饼粉5 g/L,酵母粉5 g/L,花生粉5 g/L,氯化钴20 mg/L;消后体积为35 L。

培养条件:温度28～29 ℃,流量25～30 L/min,培养时间40～50 h。

1.2.3 发酵培养基(摇瓶及100 L发酵罐)

质量浓度分别为淀粉170 g/L,黄豆饼粉28 g/L,酵母粉10 g/L,轻质碳酸钙1.6 g/L,硫酸铵0.3 g/L;淀粉酶质量分数0.025%。

摇瓶培养条件:温度27～28 ℃,转速220 r/min,接种量2～3 mL,时间14～15 d。

发酵罐培养条件:温度27～28 ℃,流量40～50 L/min,接种量6～7 L,发酵周期340～350 h。

1.3 测定方法

1.3.1 生物质量分数测定

发酵液加2～3滴有机硅消泡剂,搅拌消沫,准确称取发酵液100 g,加热至100 ℃,抽滤,适量水洗,105 ℃烘干2 h至恒重(W1)。生物质量分数表达式为

生物质量分数=(W1-W0)/100

其中W0为滤布质量。

1.3.2 效价测定

准确称取发酵液2 mL,置于50 mL容量瓶中,加适量甲醇,超声浸提15 min,定容,过滤,进HPLC系统,色谱柱C18,250 mm×4.6 mm,流动相V(CH3OH)∶V(H2O)=90∶10,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长246 nm,进样量20 μL,记录峰面积,与标准品峰面积比较测定发酵液效价(μg/mL),其表达式为

1.4 实验方案

实验以替代120 m3发酵罐黄豆饼粉用量的25%,且生物质量分数不变为基准做方案设计。首先,确定配方中应添加玉米浆的数量来弥补减少的黄豆饼粉,以确保生物质量分数不变。对减少的黄豆饼粉,用玉米浆设计了5个替代质量分数分别为25%,50%,75%,100%,125%,摇瓶发酵考察不同替代量对效价的影响。其次,考察玉米浆中限制性物质特别是磷酸盐对发酵效价的影响。由于玉米浆中磷的质量分数高达1%,如果玉米浆替代量过大,过量的磷可能影响菌体生长或产物合成。在发酵配方中添加K2HPO4·3H2O,并设计质量浓度30 mg/L和50 mg/L考察对发酵效价的影响。再次,采用L9(34)正交试验确定最优配方组合。

2 结果与分析

2.1 不同替代质量分数对发酵效价的影响

蛋白质需要在特定酸碱度、温度的条件下才能完全水解。考虑现工艺状态蛋白水解程度及玉米浆与黄豆饼粉含氮量的差别,设计了5个不同替代质量分数,即玉米浆分别按减少黄豆饼粉质量分数的25%,50%,75%,100%,125%添加,并摇瓶发酵考察不同替代质量分数对效价的影响。每个替代水平做3个发酵瓶,取平均值±标准差表示(x±s),结果见图1。数据显示:当替代质量分数为50%时,发酵效价最高,而且随着替代质量分数的增加,效价逐渐降低,这是由于阿维链霉菌菌丝生长和产物合成非偶联。配方中氮源质量浓度过高,发酵液黏度大,影响发酵液内部质量和能量的传递,生长期延长,产素期缩短;氮源质量浓度过低,产素期虽然长,但是菌体总量小,发酵效价也不高。

图1 不同替代质量分数对发酵效价的影响Fig.1 Effects of different substitutions on fermentation titer

2.2 溶磷质量浓度对发酵效价的影响

无机盐在培养基中作为微生物生长代谢所需的生理活性物质的组成成分或调节剂,在高浓度时往往对产物合成有抑制作用。实验涉及的玉米浆替代质量分数,在发酵液中溶磷质量浓度达30 mg/L,是否对菌体生长或产物合成造成影响尚不很明确[7,12],基于此,用K2HPO4·3H2O并选择质量浓度30 mg/L和50 mg/L,做摇瓶发酵培养,考察磷酸盐质量浓度对发酵效价的影响,结果(x±s)见图2。由图2数据显示:发酵配方中加入质量浓度50 mg/L的K2HPO4·3H2O,对发酵效价无显著性影响,t检验P=0.82。

图2 磷酸盐质量浓度对发酵效价的影响Fig.2 Effect of phosphate mass concentration on fermentation titer

2.3 碳、氮源优化

由于葡萄糖的分解比氨基酸复杂,过程也缓慢,菌体最初阶段利用的碳不是来自糖而是来自蛋白质的碳架,所以氮源对菌体浓度有更大的影响,并可能进一步影响初级代谢向次级代谢的转化进程。碳源氮源虽然都可用于构成微生物菌体及各种初级和次级代谢产物,但碳源的主要功能是为微生物中后期的生长代谢提供能量,两者在功能上有区别,即便同一产品不同控制条件下的发酵生产对碳氮比的要求也不同。微生物发酵是具有生命特征的高度复杂系统的连锁反应,高效的合成路线受到严密而精确的多层信号调控,任何一个条件的变化,都会引起系列的反应。玉米浆部分替代黄豆饼不仅是氮源种类及数量的变化,还涉及碳源及碳氮平衡。基于此,综合考虑有关因素,在其他原料配比不变情况下,按表1所列的因素、水平,摇瓶发酵对玉米浆、黄豆饼粉、淀粉和硫酸铵设计了拟水平L9(34)正交试验(表2),确定最优水平组合。根据极差R大小,确定4个因素对效价影响的主次顺序,黄豆饼粉>淀粉>玉米浆>硫酸铵。根据k值确定4因素最优水平组为A3B3C1D1,即质量浓度分别为淀粉174 g/L,玉米浆3.1 g/L,黄豆饼粉21 g/L,硫酸铵0.3 g/L。

表1 正交设计因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal design factors

① 淀粉;② 玉米浆;③ 黄豆饼粉;④ 硫酸铵。

表2 拟水平L9(34)正交试验Table 2 Orthogonal test of quasi-horizontal L9(34)

① 为运算方便,测定效价值应减去5 000;② 为1水平的拟水平。

为精确计算黄豆饼粉、淀粉、玉米浆和硫酸铵对发酵效价的影响程度,对表2做方差分析,结果见表3。由表3数据显示:黄豆饼粉和淀粉的P值均小于0.05,对效价有显著的影响。硫酸铵均方(MS=32 598)<误差e均方(MS=172 721),将硫酸铵的MS与误差e的MS合并为新均方e△[13]。由于蛋白质是高分子化合物,其相对分子量从几万到几千万,必须水解为小分子的氨基酸才能被菌体吸收利用,因为20种氨基酸的平均分子量128,接近于硫酸铵的分子量132.14,所以玉米浆中氨基酸,可作为速效的有机氮源,替代无机氮源硫酸铵。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

玉米浆P>0.05,仅表示在设计水平(2.9～3.1 g/L)内玉米浆质量浓度的变化对效价的影响不显著。随着替代质量分数的增加,对效价影响程度增强,因为相同数量的氮源较碳源对菌量的形成有更大的影响,对于菌丝“成球”的阿维链霉菌发酵,氮源质量浓度的控制尤其重要,毕然[14]曾研究了各种氮源物质对阿维链霉菌发酵生产阿维菌素的影响。高质量浓度的氮源将导致发酵液黏度过高,菌体代谢异常,效价增长缓慢,这时往往需要从发酵控制上做相应的调整,以尽可能的减少生产损失。

由于正交试验得到的最优方案不在试验序列中,需将优化后的方案A3B3C1与第9号A3B3C2D1试验做摇瓶发酵对照比较。将培养好的种子液接入不同配方的试验组和对照组,每组接3瓶。结果(平均值±标准差)为试验组效价=(7 984±153) μg/mL,对照组效价=(7 862±138) μg/mL,试验组较对照组高1.5%。这是由于优化后的方案和9号试验的碳源质量浓度相同(淀粉质量浓度为174 g/L),而优方案黄豆饼粉质量浓度为21 g/L,第9号试验黄豆饼粉质量浓度23 g/L,即优方案的碳氮比更高,可以减缓菌丝的衰老,有益于发酵后期效价的持续增长。微生物细胞可以通过感应环境中营养物质的浓度调节细胞行为。刘乐诗等[15]研究发现:当碳源丰富时微生物细胞会大量的摄入而且高效经济的选择以三酰甘油的形式囤积在细胞体内,在储存了大量碳源的同时又存储了大量还原力,为阿维链霉菌在发酵后期阿维菌素的生物合成提供更多的能量支持。

2.4 优化配方的验证

将优化后的配方与原配方进行优化前后效价、生物质量分数的变化情况进行考察。在100 L发酵罐上,做了5个批次的平行实验,优化前后放罐效价比较见图3,生物质量分数比较见图4。结果显示:配方优化前后,两者均无显著性差异,t检验,p效价=0.96,p生物质量分数=0.66,即玉米浆部分替代黄豆饼粉,在减少发酵费用的同时,效价和生物质量分数不受影响,降低了阿维菌素的生产成本。

图3 优化前后放罐效价比较Fig.3 Comparison of tank titer before and after optimization

图4 优化前后生物质量分数比较Fig.4 Comparison of biomass before and after optimization

3 结 论

微生物生长离不开环境中的营养物质,通常的配方设计中即有速效氮源又有缓效氮源,以满足菌体在发酵不同时期生长繁殖的需要,达到生长期缩短,产抗期延长的目的。黄豆饼粉作为缓效氮源,发酵过程中在蛋白酶的精确调控下适时、适量的水解为小分子的氨基酸,满足其在发酵中后期的需要。玉米浆作为速效有机氮源用于菌体发酵前期生长繁殖,从功能上讲,玉米浆不宜完全替代黄豆饼粉。实验结果显示:玉米浆对减少的黄豆饼粉替代质量分数为50%,在作用上,1个质量单位的玉米浆等效于2个质量单位黄豆饼粉。使用玉米浆部分替代黄豆饼粉,可以提高玉米浆附加值,实现循环利用,低碳发展的目标。与原配方比较,在减少黄豆饼粉用量的同时,不影响发酵效价,能够降低阿维菌素生产成本。