高效液相色谱法测定壮骨止痛口服膏中川续断皂苷Ⅵ含量

熊有明，崔 虹，曾 珍

（1. 重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000； 2. 重庆市万州区中医院，重庆 404000）

壮骨止痛口服膏为重庆市万州区中医院院内制剂，由黄芪、当归、续断、熟地黄、补骨脂等12 味中药组方。临床应用证实，其具有益气血、补肝肾、强筋壮骨的功效，主要用于筋骨折伤后期、腰膝酸痛、筋骨痿软等症。方中续断为君药，性微温，味苦、辛，补肝肾，可强筋骨、续折伤等。皂苷类为续断的主要有效成分，其中以川续断皂苷Ⅵ为代表，2015 年版《中国药典（一部）》[1]将川续断皂苷Ⅵ作为续断药材质量控制的指标之一。该制剂现行质量标准只有鉴别和通则检查，为提高其质量标准，保证用药安全，本研究中探讨了壮骨止痛口服膏中川续断皂苷Ⅵ的含量测定方法，为该制剂的质量控制提供了定量检测方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC －20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Mettler－XP204 型天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度为万分之一）；Sartorius－ME215S 型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

川续断皂苷Ⅵ对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111685 －201707，含量为90.9%）；壮骨止痛口服膏（重庆市万州区中医院，批号分别为20190903，20190918，20191010）；正丁醇、甲醇均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（28 ∶72，V／ V）；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃；检测波长：212 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取川续断皂苷Ⅵ对照品23.30mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液适量，以甲醇稀释成含川续断皂苷Ⅵ分别为0.021 2，0.105 9，0.211 8，0.311 7，0.529 5 mg ／mL 的系列对照品溶液。取本品2.5 g，精密称定，置250 mL 分液漏斗中，加20 mL 水溶解，用水饱和正丁醇提取5 次，每次30 mL，合并正丁醇，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按处方（不含续断）及本品工艺制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取对照品溶液( 质量浓度为0.211 8 mg／mL)、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，色谱图见图1。可见，阴性对照无干扰，方法专属性良好，且川续断皂苷Ⅵ和其他组分可达到基线分离。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：按拟订色谱条件，将2.2 项下川续断皂苷Ⅵ系列对照品溶液各10 μL 注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以川续断皂苷Ⅵ对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y ＝2.112 7 ×106X ＋261.55，r ＝0.999 9。结果表明，川续断皂苷Ⅵ进样量在0.212 ～5.295 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为0.211 8 mg ／mL的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液10 μL，重复进样6 次。结果峰面积均值为447 728，RSD 为0.89%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20190903）样品，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时进样测定，记录色谱峰面积。结果峰面积均值为370 518，RSD 为0.28%（n ＝7），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20190903）样品，依法制备供试品6 份，精密称定，依法制备供试品溶液，分别进样测定，计算含量。结果平均含量为0.771 mg／g，RSD 为0.86%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的供试品9 份，每份约1 g，精密称定，置250 mL 分液漏斗中，精密加入川续断皂苷Ⅵ对照品贮备液0.4，0.8，1.6 mL，每个浓度平行3份，依法进样测定，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3 批供试品(批号分别为20190903，20190918，20191010)，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果3 批样品平均含量分别为0.771，0.750，0.782 mg ／g。

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

壮骨止痛口服膏处方由续断、黄芪、党参、枸杞、杜仲、当归等12 种中药组方，加上辅料，成分复杂，干扰严重。曾考察氯仿、乙醚、水饱和正丁醇对提取效果的影响，结果表明，水饱和正丁醇提取较完全，并可减少辅料及其他中药组分的干扰，故最终选择用水饱和正丁醇作为提取溶剂。

表1 川续断皂苷Ⅵ加样回收试验结果（n ＝9）

3.2 波长选择

参考2015 年版《中国药典（一部）》[1]及文献[2－4]中的方法，曾同时通过在200 ～400 nm 波长范围内的全波段扫描，确定川续断皂苷Ⅵ最大吸收在212 nm 波长附近，最终确定测定波长为212 nm。

3.3 流动相选择

参照2015 年版《中国药典（一部）》[1]中续断药材含量测定项下的流动相，曾考察乙腈与水的比例，根据川续断皂苷Ⅵ的峰形、理论板数与分离度，确定乙腈－水(28 ∶72，V／ V)为流动相时分离效果较理想。

3.4 方法评价

采用HPLC 法测定壮骨止痛口服膏中川续断皂苷Ⅵ的含量，受主客观因素的干扰较小，且准确、简便，重复性好，可作为壮骨止痛口服膏的定量分析方法。