祛风消癜合剂质量标准研究

2020-07-15焦红军董风其陶明晖王皖军黄上林马超亚唐进法

中国药业 2020年13期

焦红军，董风其，陶明晖，王皖军，黄上林，马超亚，唐进法

（1. 郑州大学第二附属医院，河南郑州 450014； 2. 河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000）

临床实践证实，中医药辨证治疗过敏性紫癜具有特色和优势[1－2]。过敏性紫癜的中医证候以风热伤络证(占29.5%)为主，仅次于血热妄行证(占68.9%)，为较常见证型[3]。祛风消癜合剂源自河南中医药大学第一附属医院儿科临床治疗过敏性紫癜风热伤络证的多年经验方，由忍冬藤、荆芥、防风、徐长卿、茜草、海风藤、丹参、炙甘草8 味药材组方，具有祛风消癜、清热止痒、化瘀通络的功效，用于过敏性紫癜、色素性紫癜、荨麻疹等疾病，辨证属风热伤络者。经临床应用，该方疗效显著，不良反应少，为治疗过敏性紫癜风热伤络证的良方。为更好地促进该方院内制剂的开发和研制，推广临床应用，亟需对其质量标准进行研究。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中忍冬藤、防风、炙甘草进行定性鉴别，采用超高效液相色谱（UPLC）法对制剂中的原儿茶醛、马钱苷和5 － O －甲基维斯阿米醇苷进行含量测定，以建立祛风消癜合剂的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H－Class 型超高效液相色谱仪，包括PDA 检测器、Empower2 色谱工作站（美国Waters公司）；XS105 型电子天平（梅特勒－托利多集团，精度为十万分之一）；KQ －100DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为100 W，频率为40 kHz）；TLC VISUALIZER2 型薄层成像仪（瑞士卡玛公司）。

1.2 试药

祛风消癜合剂（河南中医药大学第一附属医院自制，批号分别为181127，181130，181201，规格为每瓶100 mL）；马钱苷对照品（批号为R23D7F27552），5 －O －甲基维斯阿米醇苷对照品（批号为P05M8F35478），原儿茶醛对照品（批号为P05M7F14533），均购自上海源叶生物有限公司；甘草苷对照品（批号为PRF8110742，成都普瑞法科技开发有限公司)；硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈和磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

忍冬藤[4－5]：取本品10 mL，水浴蒸干至2 ～3 mL，加甲醇3 mL，超声处理（功率为100 W，频率为40 kHz）10 min，离心5 min（3 500 r／min），取上清液，蒸干至2 mL，加硅胶粉5 g，混匀，置水浴锅蒸干，加于装有2 g 硅胶的G 柱（15 g，内径为1.5 ～2.0 cm），取三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下层溶液50 mL作为流动相洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加2 mL 50%甲醇溶解，作为供试品溶液；按处方制备缺忍冬藤的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液；另取马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照2015 年版《中国药典（一部）》附录ⅥB 中TLC 法试验，分别吸取供试品、阴性对照品溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置可见光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1 A。

防风[4，6]：取本品20 mL，加丙酮40 mL，混匀，过滤，滤液水浴蒸至2 mL，加入5 g 硅胶G，混匀，置水浴锅蒸干，加于装有2 g 硅胶G 的硅胶G 柱（15 g，内径为1.5 ～2 cm）上，取三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 作为流动相洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加乙醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。按处方工艺制备缺忍冬藤的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液；取5 － O－甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的对照品溶液。照2015年版《中国药典（一部）》附录ⅥB 中TLC 法试验，吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1 B。炙甘草[4]：取本品10 mL，加水饱和正丁醇溶液20 mL，萃取2 次，合并正丁醇溶液，水浴蒸干，残渣加2 mL乙醇溶解，作为供试品溶液；按处方工艺制备缺炙甘草的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液；另取甘草苷对照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照2015 年版《中国药典（一部）》附录ⅥB 中TLC 法试验，分别吸取上述3 种溶液各2 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V／ V／ V／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1 C。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm）；流动相：乙腈(A) －0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，0 ～3 min 时10% A，3 ～8 min 时10% ～20%A，8 ～15 min 时 20% ～25%A， 15 ～18 min 时 25% ～100%A；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL ／ min；检测波长：232 nm；进样量：1 μL。

2.2.2 溶液制备

图1 薄层色谱图

图2 超高效液相色谱图

取原儿茶醛、马钱苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含原儿茶醛14.28 μg／mL、马钱苷61.6 μg ／ mL、5 － O －甲基维斯阿米醇苷22.2 μg／mL 的混合对照品溶液。精密量取样品2 mL，置10mL 容量瓶中，加甲醇定容，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。按处方工艺分别制备缺丹参、缺忍冬藤和缺防风的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2 项下3 种溶液各1 μL，分别注入超高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进行测定，结果原儿茶醛、马钱苷和5 － O－甲基维斯阿米醇苷的色谱峰与其他色谱峰分离良好，且阴性对照无干扰峰，色谱图见图2。

线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液0.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7，2.0 μL 注入超高效液相色谱仪中，测定峰面积，以进样量（X，μg）为横纵坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得原儿茶醛、马钱苷和5 － O －甲基维斯阿米醇苷的回归方程分别为Y原＝18 496 X原－8 729（r ＝0.999 9），Y马＝5 507 X马－9 011（r ＝0.999 9）和Y甲＝9 022 X甲－5 258（r ＝0.999 9）。结果原儿茶醛、马钱苷和5 － O －甲基维斯阿米醇苷进样量分别在2.86 ～28.56 μg，12.32 ～123.20 μg，4.44 ～44.40 μg 范围内与峰面积线性关系良好（r ＝0.999 9）。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液1 μL，依法测定，重复进样6 次。结果原儿茶醛、马钱苷和5 － O－甲基维斯阿米醇苷对照品峰面积的 RSD 分别为1.33%，1.69%，1.66%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12h时进样1 μL，依法测定。结果原儿茶醛、马钱苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD 分别为1.19%，1.19%，1.50%（n ＝7），表明供试品溶液在12h 内稳定。

重复性试验：精密吸取同一批（批号为181127）样品6 份，依法制备供试品溶液，平行测定。结果原儿茶醛、马钱苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD 分别为2.96%，3.41%，2.87%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取已知含量的样品（批号为181127）6 份，每份1 mL，分别精密加入原儿茶醛、马钱苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）

2.2.4 样品含量测定

取祛风消癜合剂3 批，依法制备供试品溶液，每批样品平行制备2 份，再按拟订色谱条件测定含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg ／mL，n ＝2）

3 讨论

3.1 薄层鉴别样品制备方法优化

祛风消癜合剂方中药味多，成分复杂。在进行忍冬藤的薄层鉴别时，参考文献[7]，分别采用水饱和正丁醇萃取、药液蒸干50%甲醇水溶解及乙酸乙酯萃取3 种制备方法，结果各斑点分离效果均不理想，杂质干扰严重，最终采用以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／V／ V）10 ℃放置的下层溶液为流动相，过硅胶G 柱洗脱的制备方法去除杂质，结果色谱峰分离度较好，且阴性对照无干扰。在进行防风的薄层鉴别时[8－9]，分别采用丙酮除杂法、水饱和正丁醇萃取法和乙酸乙酯萃取法制备供试品溶液，结果以上方法均不能有效除杂，经进一步试验，最终先采用丙酮除去部分杂质，再用三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 为流动相，过硅胶G柱洗脱进一步除杂，制备的供试品溶液薄层色谱分离度良好，且阴性对照无干扰。

3.2 供试品提取方法和色谱条件考察

考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇及超声处理15，30，45 min 的提取效果[10－11]，发现甲醇超声处理30 min最好。采用210 ～400 nm 波长范围内紫外光谱扫描，发现最大吸收波长原儿茶醛在230 nm，马钱苷在237 nm，5 － O －甲基维斯阿米醇苷在232 nm，综合考虑，最终确定检测波长为232 nm。查阅文献[12－15]，考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液多种流动相系统，结果显示，以乙腈－0.2%磷酸水溶液为流动相时色谱峰峰形对称良好，样品峰与杂质峰能达到基线分离，故选择其为流动相。

3.3 指标成分确定

祛风消癜合剂处方中君药忍冬藤有清热解毒、疏风通络功效，以及抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[16]，其主要活性成分为马钱苷，具有增强机体免疫功能及抗炎等作用；臣药防风具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，色原酮是其主要的活性成分，现代药理学研究表明，5 －O －甲基维斯阿米醇苷具有良好的解热、镇痛、抗炎及抗血小板凝聚作用[17]；佐药丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛功效，其主要药效成分是脂溶性二萜类和酚酸类成分，酚酸类具有心脑血管活性、抗肿瘤活性、抗氧化活性等多种药理活性[18]，因样品中未检测到丹参酮ⅡA成分，且丹酚酸B 有阴性干扰，故选择原儿茶醛为含量检测指标。综合考虑，最终确定对祛风消癜合剂中的马钱苷、5 － O －甲基维斯阿米醇苷和原儿茶醛进行含量测定。