不同产地五灵脂质量研究

李筱婧，汪 晶，2，江阿古丽·艾山，韦英杰，2，许 欢，黄一平，2，江 安，陈 斌，2

（1. 南京中医药大学第三临床医学院·附属省中西医结合医院，江苏 南京 210028； 2. 江苏省中医药研究院·国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028； 3. 新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州中医医院，新疆 伊犁 835000）

五灵脂Faecestrogopterori 为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥粪便，又名药本、寒号虫粪、灵脂等，主产于河北、山西、陕西、内蒙古、吉林、新疆等地。其全年均可采收，除去杂质，晒干，味咸、甘，性温，归肝经，具有活血、化瘀、止痛功效，主治胸胁或脘腹刺痛、痛经、经闭、产后血瘀疼痛、跌扑肿痛、蛇虫咬伤[1－8]。其主要化学成分有黄酮类、三萜类、苷类、有机酸等[9]，其中最主要的双黄酮类成分是穗花杉双黄酮（amentoflavone）。目前，国内外对穗花杉双黄酮的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗微生物、降血糖、扩张血管等多种药理作用均有研究[10－13]。由于穗花杉双黄酮的显著药理活性与五灵脂的中医临床功效相符，故国内外正开展一系列新药开发研究。但1990 年版《中国药典(一部)》仅收载了五灵脂的性状、炮制、性味、功能、主治等项目，2015 年版《陕西省药材标准》中收载了其薄层鉴别法，目前并未制订五灵脂药材的含量限度，相关法定药材标准仍不完善。本研究中对不同产地五灵脂的水分及浸出物含量、穗花杉双黄酮进行薄层鉴别和含量测定[14－15]进行了研究，为五灵脂药材的质量控制和进一步开发利用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、DAD 检测器和色谱工作站，美国Agilent 公司）；MT5 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为百万分之一）；ZF－90D 型暗箱式紫外分析仪（上海广豪分析仪器有限公司）。

1.2 试药

穗花杉双黄酮对照品（批号为111902 －201603，中国食品药品检定研究院)；甲醇、磷酸均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水；五灵脂样品经江苏省中医药研究院黄一平研究员鉴定为鼯鼠科动物复齿鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥粪便，其他信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

根据外形不同，五灵脂分为灵脂米和灵脂块，常用产地中大部分为灵脂米，新疆产五灵脂多为灵脂块，详见图1。灵脂米为长椭圆形颗粒，长0.5 ～1.5 cm，直径3 ～5 mm，表面颜色为黄棕色至黑棕色不等，表面微粗糙，可见淡黄色的纤维，有的略平滑具光泽；质轻，易折断，断面黄绿色或棕褐色，纤维性；气微，详见样品1 ～9，11 ～12。灵脂块为不规则的块状，大小不一，表面黑棕色，凹凸不平，断面黄棕色或棕褐色，间或有黄棕色树脂状物质，质硬，气腥臭，详见样品10。

表1 不同产地五灵脂药材水分、浸出物含量测定结果（± s，%，n ＝3）

表1 不同产地五灵脂药材水分、浸出物含量测定结果（± s，%，n ＝3）

编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12产地内蒙古吉林湖北广东广东山西山西陕西陕西新疆河北河北批号190102341 20190313 150524 20190515 20190585 20190313 20190301 1903001 1903021 180501 180508 190301水分6.63 ±0.21 8.55 ±0.16 6.63 ±0.23 6.85 ±0.20 7.26 ±0.09 7.52 ±0.13 5.36 ±0.05 5.99 ±0.03 7.20 ±0.13 10.83 ±0.13 5.11 ±0.17 5.66 ±0.32浸出物9.26 ±0.15 10.01 ±0.11 11.20 ±0.12 9.97 ±0.05 8.94 ±0.09 9.73 ±0.08 9.54 ±0.10 10.23 ±0.22 11.07 ±0.23 8.13 ±0.09 10.61 ±0.18 10.53 ±0.25

图1 五灵脂药材样品性状

2.2 水分测定

参照2015 年版《中国药典（四部）》通则0832 水分测定法中第二法（烘干法）[15]，对12 批样品进行水分测定。取样品粉末约2 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，开启瓶盖在100 ～105 ℃干燥5 h，盖好瓶盖，移置干燥器中，放冷30 min，精密称定质量，100 ～105 ℃干燥1 h，放冷，称定质量，至连续2 次称定质量的差异不超过5 mg 为止，根据减失的质量，计算药材中含水量（%）。结果药材含水量为5.11 % ～10.83 %，详见表1。

2.3 浸出物测定

参照2015 年版《中国药典（四部）》通则2201 浸出物测定法[15]。以20%乙醇为溶剂，对12 批样品的浸出物含量进行测定。取样品粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20%乙醇50 mL，密塞，称定质量，静置1 h，加热回流1 h，放冷后，再称定质量，用20%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，量取滤液25 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，称定质量。结果醇溶性浸出物含量为8.13 % ～11.20%，详见表1。

2.4 薄层色谱鉴别

取药材粉末约1 g，置具塞锥形瓶中，加50 mL 90%甲醇，加热回流30 min，放冷，静置，取上清液滤过，取滤液25 mL，蒸干，加2 mL 甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。另取穗花杉双黄酮对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 穗花杉双黄酮的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液3 μL，对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以异丙醇－浓氨－水（13 ∶1 ∶1，V／ V／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝甲醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图2。

图2 五灵脂薄层色谱图

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：X－Bridge C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0.1%磷酸（60∶40，V／ V）；流速：1.0mL／min；柱温：25 ℃；检测波长：330 nm；进样量：10 μL。理论板数按穗花杉双黄酮峰计应不低于3 000。

2.5.2 溶液制备

取穗花杉双黄酮对照品2 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成每1 mL 含穗花杉双黄酮202.6 μg 的溶液，即得对照品溶液。取五灵脂药材粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用90%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。

2.5.3 方法学考察

专属性试验：取对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图3。在该色谱条件下，该成分达到基线分离，分离度大于1.5，理论板数大于3 000；供试品溶液色谱峰紫外吸收光谱与对照品溶液完全一致，表明其他成分对测定无干扰。

线性关系考察：取2.5.2 项下对照品溶液适量，配制成质量浓度为2.026，4.052，8.104，10.130，16.208 μg／mL的系列标准溶液。按拟订色谱条件分别进样10 μL，以质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝40.145X－5.513 3，R ＝0.999 9。结果表明，穗花杉双黄酮质量浓度在2.026 ～16.208 μg ／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取适量同一对照品溶液，按拟订色谱条件测定，连续进样6 次。结果穗花杉双黄酮峰面积的RSD 为0.31%( n ＝6)，表明仪器的精密度良好。

重复性试验：取12 号产地为河北的五灵脂药材粉末6 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果穗花杉双黄酮含量的RSD 为0.65%( n ＝6)，表明方法的重复性良好。

稳定性试验：取适量样品（批号为190301），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定。结果穗花杉双黄酮含量的RSD 为0.70%( n ＝6)，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的药材粉末0.5 g，精密称定，分别加入适量穗花杉双黄酮对照品溶液，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

2.5.4 样品含量测定

取12 批样品粉末各1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算含量。结果见表3。

图3 高效液相色谱图及紫外吸收光谱图

表2 穗花杉双黄酮加样回收试验（n ＝6）

表3 不同产地五灵脂药材穗花杉双黄酮含量测定结果（%）

3 讨论

本研究中样品来自各地方药店及中药饮片厂，可较真实全面地反映临床实际应用中五灵脂的质量。12 批五灵脂中2 批产自广东，2 批产自山西，2 批产自陕西，2批产自河北，其余分别产自内蒙古、吉林、湖北、新疆，合计8 个产地，包括灵脂米与灵脂块2 种类别。中药材中含水量超出一定范围就会直接影响药材的质量，易出现虫害、霉变、潮解等变质现象；浸出物含量是反映药材的内在质量，确保其疗效确切、质量可靠的重要指标，故本研究中对不同产地五灵脂药材的水分及浸出物含量进行了测定。

本研究中对五灵脂中穗花杉双黄酮的薄层色谱鉴别进行了改进，多数文献中对五灵脂中穗花杉双黄酮的薄层鉴别均使用聚酰胺薄膜及二氯甲烷－甲醇展开剂系统，聚酰胺薄膜不易操作，斑点拖尾，展开效果较差，重复性不好。本研究中考察了硅胶G、硅胶GF、聚酰胺薄膜等，确定了硅胶G 板为首选；考察了二氯甲烷－甲醇、乙醇－水、正丁醇－醋酸－水系统及异丙醇－浓氨－水展开系统，通过比较发现，异丙醇－浓氨－水展开系统的展开效果较好。该方法操作简便，斑点清晰，且高效、快速、简便，较其他方法更合理。

本研究中考察了冷浸、超声及回流的提取方式，以及不同的提取溶剂（乙醇、甲醇、90% 甲醇和80% 甲醇），不同提取时间及提取次数，最终确定了90%甲醇加热回流30 min 为最佳提取方法。分别考察了不同流速（0.8，1.0，1.2 mL ／min）及不同柱温（20，25，30 ℃），结果在上述色谱条件下，供试品溶液与对照品溶液相同时间出峰一致，综合分离度及峰形等因素最终选定流动相为甲醇－0.1% 磷酸（60 ∶40， V／ V），流速为1.0 mL／min，柱温为25 ℃。此外，在测定穗花杉双黄酮对照品的紫外吸收光谱图时发现，在330 nm 波长处有最大吸收，故以此为检测波长。

通过对12 批样品薄层鉴别及含量测定发现，除产地为新疆的五灵脂块外，其他批次药材均含有穗花杉双黄酮，含量在0.035% ～0.050%。考虑灵脂块是复齿鼯鼠粪便与尿液的混合物夹以少量砂石干燥凝结而成，成分较灵脂米有差异，有待深入研究。市售临床常用五灵脂饮片均为灵脂米，故穗花杉双黄酮的测定有利于五灵脂药材的质量控制，可为其进一步开发利用提供参考。