地稔多糖微波提取与回流提取工艺比较

曾荣香，陈 丽，蓝义琨，雷凯君

（广东省佛山市中医院药剂科，广东 佛山 528000）

地稔Melastoma dodecandrum Lour. 为野牡丹科植物地稔的全草[1]，喜酸性土壤，广泛分布于江浙、两广、福建、贵州、湖南等地区，其味甘、微涩，性凉，具有清热解毒消肿、活血祛瘀止血的功效，常用于治疗高热、疗疮痈肿、咽喉肿痛、痔疮、毒蛇咬伤等症[2]。地稔的多糖类成分药理作用广泛，如抗氧化、清除自由基、抗溃疡、抗炎症、抗肿瘤、抗衰老、降糖调脂等[3－4]。目前，对地稔活性成分的研究多集中于没食子酸[5－6]，但对地稔多糖的研究报道不多。多糖的提取一般采用回流提取法，目前也有关于微波提取多糖的报道[7－9]。本研究中采用单因素考察比较微波提取和回流提取的多糖提取率，通过正交试验优选地稔多糖的最佳提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：UV2550 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；BT25S 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，精度为十万分之一）；HWC－3LA 型微波提取设备（广州兴兴微波能设备有限公司）；KDM 型控温电热套（山东华鲁电热仪器有限公司）；R－200 型旋转蒸发仪（厦门精艺兴业科技有限公司）；Sorvall Legend X1 型高速大容量离心机（德国Thermo 公司）；SZ －93 型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

试药：地稔饮片（广州致信中药饮片有限公司，批号为130801）；D－无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所，批号为110833 －201204）；苯酚、浓硫酸、95%乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定

2.1.1 溶液制备

无水葡萄糖105 ℃干燥至恒重，取60.00 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，即得对照品溶液。取样品20 g，浸泡30 min，微波或回流提取，过滤，浓缩至20 mL，加4 倍量的95%乙醇，放置冰箱中醇沉过夜，离心，取沉淀稀释至1 000 mL，再取10 mL 稀释至100 mL，即得供试品溶液。

2.1.2 标准曲线绘制

分别精密量取葡萄糖对照品溶液1，2，3，4，5 mL，置50 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取2 mL 置25 mL 具塞试管中，加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加浓硫酸7.5 mL，摇匀，室温放置15 min，置冷水中冷却30 min 取出，以相应试剂为空白，按分光光度法于490 nm 波长处测定吸光度[10]。以葡萄糖质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A ＝0.047 3 C ＋0.057 4， R2＝0.998 2（n ＝5）。结果表明，葡萄糖溶液质量浓度在12 ～60 μg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。

2.1.3 样品含量测定

精密吸取供试品溶液2 mL，置25 mL 具塞试管中，按标准曲线项下操作，代入回归方程，计算含量。

2.2 单因素考察

2.2.1 微波提取

提取时间：取样品20 g，按料液比1 ∶30 加水600 mL，每个条件取3 个平行，置微波提取设备中，在700 W 功率 下 分 别 提 取5，10，15，20，25 min， RSD 分 别 为1.46%，1.14%，0.67%，0.99%，2.52%（n ＝3）。由图1可见，5 ～20 min 多糖提取率处于平稳状态，20 min 后呈下降趋势，可能是较长时间的微波辐射使多糖的稳定性下降，从而影响其含量，故微波提取时间不宜过长。

料液比：取样品20 g，置微波提取设备中，在700 W功率下提取15 min，每个条件取3 个平行，分别按1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40 的比例加水提取，结果的RSD 分别为1.03% ，0.69% ，0.88% ，1.21% （n ＝3）。由图2 可见，料液比对地稔多糖提取率的影响并不大。由于地稔饮片吸水性较强，为使药材完全浸泡，故料液比1 ∶20相对较佳。

微波功率：取样品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每个条件取3 个平行，置微波提取设备中提取15 min，分别于400，500，600，700，800 W 提取功率下提取，结果的 RSD 分 别 为1.80% ，1.20% ，0.81% ，1.20% ，0.92% ( n ＝3）。由图3 可见，多糖的提取率随着微波功率的增大而升高，但700 W 后无显著变化。

提取次数：取样品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每个条件取3 个平行，置微波提取设备中，在700 W 功率下提取15 min，分别提取1，2，3 次，结果的RSD 分别为0.91%，0.52%，0.42% ( n ＝3）。由图4 可见，地稔多糖提取率随提取次数的增多而升高。

2.2.2 回流提取

提取时间：取样品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，每个条件取3 个平行，分别提取1，2，3，4，5 h ，结果的RSD 分别为0.86% ，1.88% ，1.60% ，2.87% ，1.12%( n ＝3）。由图5 可见，1 ～2 h 多糖提取率显著增加，而2 h后随着时间的延长并无显著变化，故提取2 h 最佳。

料液比：取样品20 g，提取1 h，每个条件取3 个平行，分别按1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40 的比例加水提取，结果的 RSD 分别为0.93% ，0.59% ，0.64% ，0.37%( n ＝3）。由图2 可见，料液比对地稔多糖提取率的影响不大，故1 ∶20 相对较佳。

提取次数：取样品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，提取2 h，每个条件取3 个平行，分别提取1，2，3 次（结果的RSD 分别为0.30%，2.99%，2.26% ( n ＝3）。由图4 可见，地稔多糖提取率随提取次数的增多而升高。

2.2.3 微波辅助回流提取

取样品20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，先在700 W 功率下微波提取10 min，再回流提取2 h，平行3 次，结果的RSD 为1.03%( n ＝3）。

2.2.4 多糖提取率比较

由图1 至图5 可见，回流提取的多糖提取率增长趋势比微波提取更显著。由图6 可见，微波辅助回流提取的多糖提取率并未高于回流提取。

2.3 正交试验设计

图1 微波提取时间对地稔多糖提取率的影响

图2 料液比对地稔多糖提取率的影响

图3 微波功率对地稔多糖提取率的影响

图4 提取次数对地稔多糖提取的影响

图6 微波辅助回流提取与回流提取的比较

图5 回流提取时间对地稔多糖提取率的影响

由单因素考察试验结果可见，回流提取比微波提取更适合地稔多糖的提取，故对回流提取进行正交设计优化。选择提取时间（因素A）、料液比（因素B）、提取次数（因素C）3 个因素为考察对象，每个因素拟3 个水平，选用L9（34）正交设计优化回流提取工艺。因素水平见表1。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。可见，A 列K 值A3＞A2＞A1，B1、B2、B3相差不大，说明因素B 的三水平差不多；C 列K 值C3＞C2＞C1，说明C3比C1和C2好。由直观分析表明，因素C 的极值R 最大，为主要影响因素，其次为因素A，最后是因素B。故各因素对提取效果的影响程度依次为C ＞A ＞B。由方差分析结果可见，因素A、因素C 是极显著因素。综合考虑，优选出的最佳提取工艺为A2B1C3，即20 倍水量，提取3 次，每次2 h。

表1 L9（34）因素水平

表2 正交试验方案与结果

表3 方差分析结果

2.4 验证试验

分别称取同一批样品20 g，平行3 份，用20 倍量水浸泡30 min，提取3 次，每次2 h。在此工艺下，地稔多糖的提取率为1.12%。

3 讨论

目前，多糖提取方法有超声提取法、回流提取法、微波提取法、酶提取法等，其中超声提取技术可通过超声波的空化作用及其次级效应，如机械振动、扩散、乳化、击碎、化学效应等，促进植物有效成分溶出、扩散、释放并与溶剂充分混合[11]。预试验结果显示，超声提取地稔多糖效率很低，不利于提高药材的使用率。微波提取是将微波射线辐射于溶剂，微波射线透过细胞壁到达细胞内部，极性溶剂及细胞液可吸收微波能，导致细胞内部及附近的温度升高，细胞内气化压力增大至超过细胞壁承受能力时，细胞壁破裂，细胞内成分释放转移到溶剂中[12]。回流提取法是常规提取方法，操作简单，成本较低。酶提取法提取条件温和，提取率高，但工艺条件要求及成本也较高[13]，不利于大规模工业化生产。

本试验结果显示，微波提取达到平衡态的时间虽比回流提取时间短，但提取率明显低于回流提取，表明微波提取不适合地稔多糖。超声提取法和微波提取法操作简单，提取率高，但提取较剧烈，易造成多糖降解[14－15]。综合回流提取的单因素试验、正交试验和实际应用考虑，地稔多糖更适合的提取工艺为回流提取，最佳提取条件为料液比1 ∶20，提取3 次，每次提取2 h，此条件下的地稔多糖提取率约为1.1%。