硝酸益康唑微乳凝胶的制备及其体外释放研究

丁 乐，杨人泽 ，李小兰，肖人钟，欧阳文，严金玲，申 音，魏桂林

（1. 江西省赣州市妇幼保健院，江西 赣州 341000； 2. 赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000；3. 江西昂泰制药有限公司，江西 九江 332300）

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；RCZ －6C3 型智能药物溶出度仪（上海黄海药检仪器有限公司）；HWS－1 型数显恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）；XP26 型电子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度为百万分之一）；NDJ－8S 型数显旋转黏度计（上海精天电子仪器有限公司）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；硝酸益康唑（浙江常青化工有限公司，纯度为98.6%）；硝酸益康唑对照品（中国食品药品检定研究院）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

屏障环境昆明种小鼠，雌雄不限，体质量20 ～30 g，由赣南医学院实验动物中心提供，许可证号为SYXK(赣)2018 －0004。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－醋酸缓冲液（75 ∶25，V／ V，pH ＝4.3）；柱温：30 ℃；流速：1 mL／min；检测波长：232 nm；进样量：10 μL。按硝酸益康唑峰计算，理论板数不小于5 000。

2.1.2 微乳和微乳凝胶破乳

取1 g 微乳或微乳凝胶，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加5 mL 甲醇，超声破乳，加甲醇定容。再取0.5 mL溶液置10 mL 容量瓶中，加流动相定容，即得。

2.1.3 方法学考察

一种新技术的诞生和普及，也常常会对当时的社会、经济生活产生暂时的负面影响。人工智能的机器人等自动化系统在某些行业领域中比人类在功能、效率、成本乃至稳定性方面更具优势。企业出于经济效益的考虑，显然更愿意在这些领域，减少甚至不用人力。如果在目前的出租车行业广泛应用无人驾驶技术来取代人类司机，显然会导致出租车司机的大量减少；甚至在餐饮行业如海底捞等企业，已开始推出智慧餐厅并正式营业，实现了等位点餐、厨房配菜、调制锅底和送菜的全程“无人化”，同样会减少员工岗位，但也会创造新的岗位。

硝酸益康唑对照品、空白微乳、硝酸益康唑微乳按拟订色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图，详见图1。硝酸益康唑与杂质峰分离良好，杂质峰对测定结果无干扰。依法制备质量浓度分别为1，2，4，6，8，10 μg／mL 的对照品溶液，进样20 μL。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y ＝34.624 X－2.101 5，R ＝0.999 3，结果表明硝酸益康唑质量浓度在1 ～10 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

2.2 表观溶解度测定

分别取2 mL 选定的油、表面活性剂、助表面活性剂，分别置5 mL 带塞小瓶中，再加入过量的硝酸益康唑，涡旋混合。将小瓶置（37 ±1.0）℃的摇床，保持48 h，以达到平衡。取出，以3 000 r／min 离心15 min，取上清液，加甲醇稀释，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，采用高效液相色谱(HPLC)法测定硝酸益康唑含量，计算其在不同溶剂中的溶解度[4]。结果见表1。根据测定结果选择表观溶解度最高的油酸乙酯为油相，Tween 80 为表面活性剂，聚乙二醇400(PEG 400)为助表面活性剂。

表1 硝酸益康唑在各溶剂中的表观溶解度（n ＝3）

2.3 伪三元相图构建

当表面活性剂（ Tween 80 ）／助表面活性剂（ PEG 400）比值（Km）分别为1.0，2.0，3.0 时，分别将油相和混合乳化剂以1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6 ∶4，7 ∶3，8 ∶2，9 ∶1 的质量比例混合成二元液，置圆底烧瓶中，以纯化水为水相在滴定管内逐滴滴入上述二元液，以体系由澄清变浑浊再变澄清时为滴定终点，记录所滴定的水相体积，绘制空白微乳伪三元相图[5]。各Km 值下的伪三元图见图2。微乳区为灰色阴影部分。当Km 值由1.0 增大至2.0 时，微乳区域增大；但当Km 值由2.0 逐渐增大时，微乳形成的区域缩小。故选择Km 为3 ∶1。

2.4 表征[2，6 －7]

微乳制备：通过构建伪三元相图确定微乳区域。当Tween 80 ／PEG 400( m ／ m)为2 ∶1 时，伪三元相图有最高的微乳区域面积，因此选择表面活性剂与助表面活性剂质量比为2 ∶1。制备含量为1 % 硝酸益康唑的100 g微乳，药物溶解度最低要求39.3 mL 油，故按油相百分比大于40%设计微乳处方，详见表2。在油酸乙酯、表面活性剂和辅助表面活性剂混合物中加入质量比为1%（m ／ m）的硝酸益康唑，在恒温水浴（37 ℃）磁力搅拌下逐一滴加水形成微乳。

图1 高效液相色谱图

图2 Tween 80 ／PEG 400 不同比值的伪三元图

表2 混合乳化剂制备微乳处方（m ／ m，%）

微乳凝胶制备：取0.5 % 卡波姆940 分散在水中，溶胀后，快速搅拌，并缓慢加入上述硝酸益康唑微乳。当微乳液加入水凝胶中时，体系黏度降低，继续搅拌15 min，即得半透明的硝酸益康唑微乳凝胶。

表征：微乳透光率评估用紫外分光光度计于620 nm波长处观察。采用2015 年版《中国药典（四部）》中0982粒径和粒度分布测定法第三法（光散射法）测定粒径。参照2015 年版《中国药典（四部）》测定pH 及Zeta 电位。结果，微乳的pH 为6.5 ～6.8，所得制剂的pH 均在皮肤的pH 范围内（pH 为4 ～7）。微乳粒径尺寸是关键参数，尺寸越小，为药物渗透提供的界面表面积就越大。粒径采用激光粒度仪测定，温度为37 ℃。微乳粒径分布范围较窄，呈正态分布，平均粒径均小于50 nm。采用NDJ－8S 型数显旋转黏度计，（20 ±1）℃测定微乳和微乳凝胶的黏度，结果微乳（F3）黏度为156.73 mPa·s，微乳凝胶（FG3）黏度增加至13.6 Pa·s。详见表3。

稳定性：在(40 ±2)℃和相对湿度(75 ±5)% 条件下，放置30 d。结果见表4，微乳凝胶无显著变化，无相分离或药物沉淀的迹象，表明优化硝酸益康唑微乳凝胶在室温下在30 d 内稳定。

表3 用于评价不同微乳的数据（n ＝3）

表4 微乳凝胶（FG3）30 d 内稳定性试验结果（n ＝3）

2.5 体外扩散试验

取20 ～25 g 健康昆明种小鼠，试验前1 d 用8 %的Na2S 溶液去背毛。断颈处死，取背部皮肤，用蒸馏水和生理盐水冲洗，刮去皮下脂肪组织和粘连物，冷冻保存。使用改良Franz 扩散池。将硝酸益康唑微乳1 mL、含有等量硝酸益康唑的微乳凝胶和硝酸益康唑普通凝胶分别置供给池中，渗透面积为0.85 cm2，扩散池中以30%甲醇生理盐水为接受液，接受池体积为5 mL。在接收室内加满扩散介质，水浴保温（37 ±1）℃，100 r／min 搅拌，分别于1，2，3，4，5，6 h 时抽取接收室内0.5 mL 接收液，并迅速补充等体积接收液。将取得的样品注入高效液相色谱仪，测定硝酸益康唑的含量。

测定抽取样品中硝酸益康唑的浓度后，按下列公式计算单位面积（cm2）药物累积渗透量（Q）。

其中， Cn为第 n个取样点质量浓度（mg ／ mL）；V0为扩散池体积（mL）；Ci为第i 个取样点质量浓度（mg／mL）；V 为取样体积（mL）；A 为扩散面积（cm2）。采用SPSS 13.0 统计学软件计算药物累积经皮渗透量。体外皮肤渗透试验表明，与24 h 结束时硝酸益康唑普通凝胶释放率[（62.59 ±0.26）% ]相比，微乳凝胶的药物释放率更高[（86.79 ±0.17）%]，详见图3。

2.6 皮肤刺激性测试

图3 硝酸益康唑微乳凝胶和普通凝胶通过大鼠皮肤累积渗透比较

选择健康无皮肤伤的大鼠6 只，分为两组，两侧去毛1 cm2，取无损伤者3 只，进行完整皮肤的刺激试验；取3 只将脱毛区皮肤用75%乙醇消毒，用灭菌大头针将消毒皮肤划破，以渗血为度。采用同体左右侧自身对比的方法，按每只1 mL 的剂量在脱毛区左侧涂搽受试药物，右侧涂搽蒸馏水作对照。用药后24，48，72 h 时检查大鼠的刺激迹象。结果显示，治疗组在治疗部位没有显示任何皮肤过敏和炎症的迹象，无红斑形成，无水肿出现；破损皮肤组和完整皮肤组大鼠涂受试物皮肤均未见差异。优选的微乳凝胶均适用于局部应用。

3 讨论

外用制剂用于药物穿透皮肤或黏膜，在其应用部位产生局部效应。经皮给药系统的主要优点是能选择性地将药物输送到特定部位，产生局部作用，其增加了生物半衰期短、治疗窗口窄药物临床应用的可能，并增加了药物作用持续时间[8]。

微乳是由乳化剂、助乳化剂、油相和水相组成的光学上各向同性，热力学稳定的液－液分散体，粒径为5 ～200 nm。由于其独特的增溶性能，微乳作为潜在的药物输送系统引起了越来越多的关注，无论是作为局部应用的载体，还是作为难溶性活性药物成分（API）的生物利用度增强剂[9]。微乳液具有热力学稳定、光学清晰、易于制备的优点，与无表面活性剂体系相比，具有较高的扩散和吸收速率[10]。作为一种新型药物载体，微乳优势独特，热力学稳定，可过滤，易制备，保存方便，可提高水溶性差药物的生物利用度，透皮能力强[11－12]，疗效提高。

微乳凝胶（乳剂型凝胶）含有乳剂和凝胶基质，当局部应用黏膜给药时，药－时曲线下面积有很大提高[13]。卡波姆为引湿性很强的粉末，不溶解于水，能迅速溶胀，形成水性凝胶，是微乳凝胶的常用基质。

本研究中制备的1%硝酸益康微乳，性质稳定，显著增加了硝酸益康唑的溶解度。微乳中加入卡波姆940，可使微乳制备成凝胶后黏度增加[2]。药物释放时需先从微乳内相扩散到外相，然后再从凝胶的网状结构中渗透出来，因此渗透速度会有所下降；也可能是由于卡波姆的加入使得微乳的结构发生转变，由内外两项转变为液晶结构或更高秩序的微结构。这与刘继勇等[14]的研究结果一致。

因此，微乳凝胶提高了硝酸益康唑的溶解性、稳定性和透皮率，可进一步研究硝酸益康唑微乳凝胶的药效。