两种含氟芳酰胺季鏻盐的合成及其细胞毒性研究

田雨晴，周炜，娄兆文

(湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一[1].由于疗效及毒副作用等问题，抗癌化疗药物临床应用的实际效果并不显著，还远远不能满足人类的需求.开发较氟尿嘧啶(5-FU)[2]，顺铂(DDP)[3],紫杉醇(TAX)[4]和木豆素衍生物[5]等临床用药更有效、更安全、更廉价的新型抗肿瘤药物，意义重大.

在长期研究季鏻盐化合物的抗肿瘤活性[6]基础上，本研究对前期报道[7]合成的两个合成路线相对简单、预计成本低廉、初筛药效明显的季鏻盐化合物进行了进一步研究，以间三氟甲基苯胺为原料，氯代烷酰氯为连接基团，通过优化合成方法，以期提高目标物产率，尤其是提高产物纯度；以5-FU为阳性对照，通过CCK8法，测试氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻和氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻对人表皮癌细胞(A431)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87-MG)、人肝永生化细胞(THLE-2)、人肝癌细胞(QGY-7701)、人肺退行性癌细胞(CALU-6)、人结肠癌细胞(SW-480)、人子宫内膜癌细胞(ISHIKAWA)、人胃癌细胞(NCI-N87)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和人肝癌细胞(Hep G2)的毒性，以期进一步评价化合物的抗肿瘤活性.

图1 氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻

图2 氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻

1 合成方法优化

1.1 仪器与材料INOVA 600MHZ核磁共振仪(美国瓦里安生产)，Spectrum one型红外分光光度计(美国 PE公司)，LCMS-8040三重四极杆液相色谱质谱联用仪(日本岛津).所有化学试剂均为市售化学纯或分析纯试剂.

图3 氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻合成路线

1.2 氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的合成取0.646 g(4.01 mmol)间三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.405 g(4.00 mmol)三乙胺.冰水浴，搅拌，滴加经20 mL氯仿稀释的0.559 g(4.40 mmol)3-氯丙酰氯.反应20 min后，依次用饱和碳酸钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，水相再用氯仿萃取.合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，得中间体3-氯丙酰间三氟甲基苯胺粗产品.中间体无需纯化，直接加入0.972 g(3.71 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯，加热冷凝回流约48 h.减压蒸馏除去溶剂后，用硅胶柱层析分离(先甲苯洗脱三苯基膦及易溶有机物，再以甲苯-乙醇[体积比9∶1]洗脱)，得到油状物质0.982 g，产率47.65%(文献[7]中为43.48%),IR(KBr)cm-1:3 406.59,2 867.24,1 680.97,1 602.95,1 568.51,1 486.64,1 449.25,1 340.65,1 282.35，1 257.87,1 171.04,1 113.60,1 069.40,722.39,692.58，527.36(文献[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.74(s，1H);8.21(s,1H);7.89(d,J=8.40 Hz,1H);7.89～7.81(m,15H);7.80(t，1H);7.36(d，J=4.07 Hz,1H);3.84(t,J=8.12 Hz,2H);3.24(t,J=8.44 Hz,2H)(文献[7]).

图4 氯化-N-间三氟甲基苯基-N-丁酰胺基三苯基鏻合成路线

1.3 氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的合成取0.804 g(4.99 mmol)间三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.506 g(5.00 mmol)三乙胺，冰水浴搅拌，滴加经20 mL氯仿稀释的0.775 g(5.50 mmol)4-氯丁酰氯.反应约20 min后，依次用饱和碳酸钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，水相再用氯仿萃取.合并有机相，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，得中间体4-氯丁酰间三氟甲基苯胺粗产品.中间体无需纯化，直接加入1.230 g(4.69 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯.加热冷凝回流约48 h.减压蒸馏除去溶剂后，用硅胶柱层析分离(先甲苯洗脱三苯基膦及易溶有机物，再以甲苯-乙醇[体积比9∶1]洗脱)，得到白色固体1.12 g，产率42.43 %(文献[7]中为11.44%).IR(KBr)cm-1:3 417.80,2 944.87,1 681.62,1 604.70,1 532.62,1 439.03,1 326.87,1 258.50,1 159.48,1 114.98,1 067.68,1 016.62,848.97,743.45,691.94,532.96(文献[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.53(s,1H);8.30(s,1H);7.98(d,1H);7.82～7.67(m,15H);7.32(t,1H);7.24(d,1H);3.60(m,2H);3.05(t,2H);2.08(d,2H)(文献[7]).

1.4 合成方法改进及质谱验证与文献相比，为提高产品纯度，本研究在减少酰氯比例基础上，增加了溶剂稀释活性反应物氯代烷酰氯的步骤，以便控制反应速率；取消了合成中间产物酰胺过程中加热冷凝回流步骤，防止非酰基C―Cl键的氯水解、胺解等副反应.根据产物特性，在纯化最终产品时，采取了分段淋洗方案，即先用甲苯洗脱三苯基膦及其它易溶有机物杂质，再用甲苯-乙醇(体积比为9∶1)分离目标产物，提高了产率和产品纯度.

两个化合物的质谱图见图5、图6.

图5 氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的质谱

图6 氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的质谱

图5、图6表明，氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻Mr为513.92，氯化N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻Mr为527.95，且(M―Cl)∶(M―Cl+2)≈3∶1，进一步验证了所得化合物结构与纯度.

2 细胞毒性研究

2.1 实验材料肝脏THLE-2正常细胞株、肝癌HepG2、QGY-7701细胞株、肺癌Calu-6细胞株、胃癌NCI-N87细胞株、乳腺癌MDA-MB-231细胞株、结直肠癌SW480细胞株、宫颈癌Ishikawa细胞株、皮肤癌A431细胞株、胶质瘤U-87 MG细胞株由武汉合研生物医药科技有限公司提供.

2.2 CCK8法检测前1天，将细胞接种于96孔细胞板中，每孔接种80 μL细胞悬液，37 ℃，5% CO2培养箱，孵育过夜.实验当天，根据实验要求，每孔加入20 μL化合物工作液,37 ℃，5% CO2培养箱，孵育48 h.结束孵育后，往细胞板中加入CCK8 10 μL/孔，置于37 ℃和5% CO2培养箱中孵育1～2 h.在Nivo上测定450 nm波长处的吸光度，计算活率.

计算方法(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)：

细胞活率/%=ODs/AVER(ODNC)×100%，

其中：ODS：样品孔的吸光值(待测化合物)；ODNC：阴性孔吸光值(细胞+培养基+DMSO).

2.3 检测结果检测结果见表1.

表1 两个季鏻盐与细胞作用的IC50

其中，氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻简称“丙盐”，氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻简称“丁盐”.10种细胞分别为：人表皮癌细胞(A431)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87-MG)、人肝永生化细胞(THLE-2)、人肝癌细胞(QGY-7701)、人肺退行性癌细胞(CALU-6)、人结肠癌细胞(SW-480)、人子宫内膜癌细胞(ISHIKAWA)、人胃癌细胞(NCI-N87)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肝癌细胞(Hep G2).

3 结果与讨论

3.1 季鏻盐抗癌作用分析表1结果表明，氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻总体的IC50小于氯化-N-间三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻，说明前者有更强的抗肿瘤活性.两种季鏻盐对THLE-2(人肝永生化细胞)、A431(人表皮癌细胞)和NCI-N87(人胃癌细胞)抑制活性较强.与文献[8]比较，3-(邻三氟甲基苯胺基酰基)丙基三苯基膦对小鼠肉瘤细胞(S180)的IC50=23.49 μmol·L-1，而氯化-N-间三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基季鏻盐对人表皮癌细胞(A431)、人胃癌细胞(NCI-N87)的IC50较前者低，说明此季鏻盐三氟甲基位置的不同，对癌细胞的抑制作用不同，且间位的活性相对较弱.

3.2 问题分析在本研究中，共使用了9种癌细胞和1种正常细胞，其中人肝癌细胞(QGY-7701)、人肝癌细胞(Hep G2)和人肝永生化细胞(THLE-2)属于人体相同器官，而人表皮癌细胞(A431)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(Μ87-MG)、人肺退行性癌细胞(CALΜ-6)、人结肠癌细胞(SW-480)、人子宫内膜癌细胞(ISHIKAWA)、人胃癌细胞(NCI-N87)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)并没有使用相对应同种部位的正常细胞进行试验.若两种季鏻盐对于以上癌细胞所在同种器官或组织的正常细胞的毒性较小，则可以认为这两种季鏻盐对于某种癌症的治疗有较为出色的表现，这需要进行更多的细胞测试，而本研究的数据不足以说明这一点.

文献[7]中检测数据表明，对小鼠肉瘤细胞S180，5-氟尿嘧啶的抑制率为38.82%(50 μg/mL)，要比氯化-N-间三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻97.54%(50 μg/mL)低很多；而本研究参照文献[9]值，对HepG-2(人肝癌细胞)，5-氟尿嘧啶的IC50=(9.92±1.09)μmol·L-1，氯化-N-间三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻的IC50为36.20 μmol·L-1，弱了大约314，说明尚需进行深入细致的研究.

4 结论

本研究优化了两个具抗肿瘤活性的季鏻化合物的合成条件，显著提高了产品的产率和纯度，为该类化合物的进一步应用研究积累了有益的数据.本研究表明，氯化-N-间三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻具有较强的抗肿瘤活性；在评价这类化合物的细胞毒性时，化合物结构与活性相关但其规律性尚未明确，且生物活性的研究方法不同结果也存在明显差异；要判断该类化合物的药用价值与应用前景，尚需进一步深入研究.