葵花籽油甘油二酯的制备及其在发酵乳应用中的特性研究

张秀秀，李少华，薛秀恒，孔德瑞

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，合肥 230036)

DAG是油脂的天然成分，含量较低，具有降低餐后血脂水平、抑制体内脂肪积累、缓解糖尿病、抗动脉粥样硬化、防血栓、抑菌等功能特性。DAG主要存在两种同分异构体，即1,2-DAG和1,3-DAG，两者比例为3∶7[1-4]。研究表明，1,3-DAG对抑制体脂积累和防止体重增加具有积极作用[5-8]。近年来关于动物油DAG的研究较多，但动物油DAG含有较多的饱和脂肪酸(SFA)，过多摄入饱和脂肪酸可诱导心血管疾病的发生，对人体健康产生不利影响。因此，开发富含不饱和脂肪酸的植物油DAG用于食品生产十分重要。祝雨筱[9]采用高油酸葵花籽油与无水乙醇在油醇摩尔比1∶50、脂肪酶Lipozyme 435添加量6%(占底物总质量)、反应温度50℃下反应 1 h，1,2-DAG得率约为88%。DAG独特的分子结构同时具备较好的亲油性和亲水性，因此可作为乳化剂[10-12]应用于食品及其他行业中。贺可琳等[13]将鸭油1,3-DAG作为一种食品添加剂加入脱脂奶粉中，发现添加一定量的鸭油1,3-DAG能明显改善脱脂奶粉的分散性、冲调性和稳定性。

葵花籽油是我国使用最广泛的植物油之一，与动物油相比含有较多的多不饱和脂肪酸(PUFA)。其中亚油酸被誉为“血管清道夫”，具有保护心血管、降血脂、延缓衰老、提高免疫力、促进骨骼发育和提高记忆力等功能[14-16]。以葵花籽油为原料制备的富含亚油酸DAG不仅可以用于替代乳脂甘油三酯的功能性油脂，也可同时用于肥胖人群及其相关疾病人群的治疗。但葵花籽油来源的DAG，由于富含不饱和脂肪酸，其与含饱和脂肪酸含量较高的乳脂DAG相比，质构特性有所不同。因此，利用制得的富含亚油酸DAG开发富含亚油酸DAG的发酵乳制品，并研究其品质特性的变化具有一定的理论与实际意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

葵花籽油(山东鲁花集团有限公司)；富含1,3-DAG乳脂(提取自安佳黄油，上海恒天然贸易有限公司)；新西兰安佳脱脂奶粉(上海恒天然贸易有限公司)；诺维信435脂肪酶(诺维信集团)；SH-486乳酸菌(丹麦科汉森有限公司)；氯化钠、吐温-80、氢氧化钠、氨水、硫酸、乙醚、石油醚，分析纯；甲醇、正己烷、异丙醇，色谱纯(美国Fisher公司)。

CP244C电子天平，HH-S恒温水浴锅，Fluko高速分散器(上海FlukoLU有限公司)，APV 2000超高压纳米均质机(德国APV公司)，Allegra 64R型贝克曼高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，7890B气相色谱仪(美国Agilent公司)，Luna silica C18色谱柱(美国Phenomenex公司)，1525系列高效液相色谱仪(美国Waters公司)，2414示差检测器(美国Waters公司)，R/S Plus黏度计(美国Brookfield公司)，HR-1旋转流变仪(美国TA公司)，CT3质构仪(美国Brookfield公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 葵花籽油DAG的制备

参照王志耕等[17]的方法并作改进。称取葵花籽油、甘油、诺维信435脂肪酶于250 mL锥形瓶中，于气浴恒温振荡器53℃、200 r/min条件下振荡反应一段时间。结束后，将上清液移入离心管中，以5 000 r/min离心5 min。收集上清液在70℃下加热 10 min 以使残留的酶失活，得到葵花籽油DAG。DAG含量的测定在实验室已有的标准曲线基础上，采用高效液相色谱法测定，具体方法参照文献[17]。

1.2.2 脂肪酸组成及含量测定

参照GB 5009.168—2016方法对样品进行前处理。色谱条件：HP-88气相毛细管柱；氢火焰离子化检测器温度280℃；进样口温度250℃；分流比100∶1，载气为氮气,流量2 mL/min；进样量1 μL。用相对保留时间定性，用峰面积归一化法定量。

1.2.3 葵花籽油DAG的酸价、皂化值、碘值的测定

参照GB/T 5530—2005测定酸价，参照GB/T 5534—2008测定皂化值，参照GB/T 5532—2008测定碘值。

1.2.4 DAG部分替代乳脂酸奶的制备

1.2.4.1 酸奶的制备

将脱脂奶粉与蒸馏水以质量比1∶7混合，加入5%白糖，分别加入2%葵花籽油DAG、乳脂DAG和乳脂,用高速分散器分散均匀；再通过超高压纳米均质机将乳液混合均匀，90℃下水浴灭菌20 min；冷却至42℃以下，接种0.07%的菌粉(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，密封，42℃发酵4.5 h，然后置于4℃冰箱后熟18 h，得到3组酸奶样品。

1.2.4.2 酸奶流变特性测定

静态流变测定[18]：采用黏度计测量，使用具有CC40探头的同轴圆筒夹具测量25℃下酸奶的流变性质。每组测试均做3次平行。

动态流变测定：采用HR-1旋转流变仪对酸奶样品进行测定，使用直径40 mm圆形平行板，样品与平行板间隙为1 mm，设置测量温度25℃，扫描应变0.2%，测定角频率范围为0～100 rad/s。

1.2.4.3 酸奶质构特性测定

使用CT3质构仪进行酸奶样品的凝胶质构的测定。选择P-36R探针，设置测定条件：测前速度2.0 mm/s，测试速度2.0 mm/s，测后速度2.0 mm/s，压缩比50%，触发力5 g。每组测试均做3次平行。

1.2.5 数据分析

本试验用Microsoft Excel 2013软件进行数据的录入和统计，采用SPSS 19统计学软件进行方差显著性分析，采用Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 葵花籽油DAG制备单因素试验

2.1.1 醇油质量比对DAG含量的影响

在酶添加量7%、反应时间12 h条件下，研究醇油质量比(甘油与葵花籽油质量比，下同) 对DAG含量的影响，结果如图1所示。

图1 醇油质量比对DAG含量的影响

由图1可知，醇油质量比达到1∶10时，DAG含量达到最大值，继续增加葵花籽油量，DAG含量降低，这可能是由于随着葵花籽油量增加，底物与酶的接触面积降低。因此，最佳醇油质量比为1∶10。

2.1.2 酶添加量对DAG含量的影响

在醇油质量比1∶10、反应时间12 h条件下，研究酶添加量对DAG含量的影响，结果如图2所示。

图2 酶添加量对DAG含量的影响

由图2可知，酶添加量在4%～7%之间时，DAG含量随着酶添加量的增加而逐渐升高，但酶添加量超过7%后，DAG含量呈下降趋势。原因可能是脂肪酶含量过高时，大部分脂肪酶颗粒会沉积在容器底部，在该反应条件下未能充分分散，导致底物与酶不能充分接触。因此，最佳酶添加量为7%。

2.1.3 反应时间对DAG含量的影响

在醇油质量比1∶10、酶添加量7%条件下，研究反应时间对DAG含量的影响，结果如图3所示。

图3 反应时间对DAG含量的影响

从图3可以看出，DAG含量随着反应时间延长先上升后下降，反应时间为12 h时， DAG含量达到最高值。因此，最佳反应时间为12 h。

2.2 葵花籽油DAG制备的响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果

以醇油质量比(A)、酶添加量(B)、反应时间(C)为自变量，DAG含量(Y)为响应值，设计响应面试验优化葵花籽油DAG制备工艺。响应面试验设计及结果如表1所示，方差分析如表2所示。

表1 响应面试验设计及结果

表2 方差分析

注：**表示影响极显著(P<0.01)，*表示影响显著(P<0.05)。

利用Design Expert软件对表1试验结果进行多元回归拟合分析，得到DAG含量的二次多元回归方程：Y=48.36+0.37A+1.04B+0.68C-0.068AB+0.14AC-0.12BC-1.24A2-4.16B2-2.05C2。

由表2可知：回归模型P<0.01，说明回归模型极显著；失拟项P=0.105 4>0.05，失拟项不显著，说明对葵花籽油DAG响应面试验的拟合情况较好，可以用于葵花籽油DAG制备工艺的优化。对葵花籽油DAG含量的影响由大到小依次为酶添加量(B)>反应时间(C)>醇油质量比(A)。B2、C2对葵花籽油DAG含量影响极显著(P<0.01)，B、A2、BC对葵花籽油DAG含量的影响显著(P<0.05)，表明试验因素对响应值的交互作用关系不是简单的线性关系。

2.2.2 葵花籽油DAG制备最佳工艺条件的确定及验证

根据响应面试验结果，可确定制备葵花籽油DAG的最佳工艺条件为醇油质量比1∶10、酶添加量7.13%、反应时间12.35 h，此时反应产物中DAG含量为49.52%。在最佳工艺条件下进行3次验证试验，制得葵花籽油DAG中DAG平均含量为49.21%。实际值与预测值之间无显著差异(P>0.05)。因此，基于此方法优化的工艺条件准确可靠，有实用价值。

2.3 葵花籽油DAG脂肪酸组成

采用2.2优化制备条件，以乳脂为原料制备乳脂DAG，检测甘油解反应前后葵花籽油与乳脂中的脂肪酸组成，结果如表3所示。

表3 反应前后葵花籽油和乳脂脂肪酸含量变化 %

由表3可知，乳脂中脂肪酸组成主要为棕榈酸，约占总脂肪酸的45%，反应后饱和脂肪酸含量无显著变化，但不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸含量有所下降。葵花籽油的亚油酸含量高达68.84%，甘油解反应后不饱和脂肪酸含量下降，单不饱和脂肪酸含量升高,可能是酶解促进了亚油酸向油酸的转化。

2.4 葵花籽油DAG的基本性质(见表4)

表4 葵花籽油DAG的酸价、皂化值和碘值

由表4可知：由于反应过程中产生了副产物游离脂肪酸，使得反应后乳脂DAG和葵花籽油DAG的酸价升高；随着甘油三酯含量减少，甘油二酯含量明显增多，并出现甘油一酯，皂化值下降；反应后不饱和脂肪酸含量降低，造成碘值下降，且葵花籽油相较于乳脂的碘值更高，这与植物油的不饱和脂肪酸含量较高有关。

2.5 不同DAG对酸奶流变特性的影响

2.5.1 静态流变性质(见图4)

图4 酸奶样品的表观黏度和触变性

从图4A可以看出，3组酸奶样品表观黏度随剪切速率增加均呈逐渐下降后趋于平稳趋势，且均表现出假塑性流体特性。在剪切前期由于剪切应力的增加，发酵乳液在外力作用下分子网状交联结构遭到破坏，导致乳液变稀，表观黏度急剧下降。随后表观黏度呈现缓慢下降趋势，甚至趋于平稳。葵花籽油DAG酸奶表观黏度略高于乳脂DAG酸奶和乳脂酸奶。触变环是剪切速率由低到高和由高到低的两个对应过程图形的上行曲线和下行曲线之间形成的环状回路，环面积越大，表示该流体触变性越好[19]，组织黏弹性越好，组织结构更加稳定。从图4B可以看出，葵花籽油DAG酸奶触变环面积明显高于另外两组，说明葵花籽油DAG酸奶具有较好的触变性，凝胶结构更加稳定。可能原因是葵花籽油DAG酸奶中不饱和脂肪酸的存在促进了脂肪球膜与酪蛋白之间相互作用，使网络结构更加紧密。

2.5.2 动态流变性质(见图5、图6)

图5 动态模量随角频率变化曲线

图6 tanδ随角频率变化曲线

储能模量(G′)和损耗模量(G″)在一定程度上分别对应体系的弹性和黏性，G′较高时，体系弹性较大，G″较高时，体系黏性较好。由图5可以看出，酸奶体系的G′和G″均随角频率的增加而呈现逐渐增加的趋势，说明增加外在作用力，体系形变越大，而恢复形变所需能量将增大，表现出明显的黏弹性。葵花籽油DAG酸奶和乳脂DAG酸奶体系的G′与G″较乳脂酸奶高，说明植物油DAG和乳脂DAG的添加会增加酸奶体系的黏弹性特征。葵花籽油DAG酸奶的动态模量始终高于乳脂DAG酸奶，这与植物油中的脂肪颗粒较动物油更易与酪蛋白粒子之间发生交联有关，动态流变测定结果与静态流变结果一致。

从图6可以看出，酸奶体系的损耗因子(tanδ)均小于1，说明其弹性性能始终略高于黏性性能，这表现为一种弱凝胶动态流变学特征。乳脂DAG酸奶tanδ较大，其乳液体系更趋向于固态，流动性低。葵花籽油DAG酸奶tanδ一直处于较低状态，说明葵花籽油DAG酸奶体系表现出较好的流动性，相对于乳脂DAG酸奶黏性更大。

2.5.3 酸奶质构测定结果(见表5)

表5 酸奶样品的质构指标测定结果

由表5可知，3组酸奶样品的坚实度、稠度、黏度等受到油脂类型的影响，且与上述油脂的不饱和脂肪酸含量呈正相关，葵花籽油DAG酸奶的坚实度和稠度最高，说明其发酵过程中蛋白质的交联程度高。黏度由高到低依次为葵花籽油DAG酸奶>乳脂DAG酸奶>乳脂酸奶，与流变测定结果一致。

3 结 论

研究表明，获得葵花籽油DAG最佳酶解制备工艺条件为：甘油与葵花籽油质量比1∶10，酶添加量7.13%，反应时间12.35 h。在最佳条件下，酶解反应制备葵花籽油DAG中DAG含量可达49.21%，亚油酸含量为60.17%。葵花籽油DAG替代乳脂可增加酸奶的不饱和脂肪酸含量，改善酸奶的黏弹性和质构特性，为其在食品中的应用及新型酸奶产品的开发提供了一定的理论基础。