ABO正反定型不符病例基因测序分析1例

陈 琼,黎勤云,朱长太

(上海健康医学院附属第六人民医院东院输血科,上海 201306;*通讯作者,E-mail:zct101@163.com)

ABO血型系统是最早发现的血型系统,正确鉴定ABO血型是保证临床输血安全有效的前提。由于生理或病理原因引起ABO抗原或抗体减弱造成的ABO正反定型不符,常常会干扰ABO血型的正确定型,本文以1例血型鉴定出现混合视野进行分析,现报告如下。

1 病例报告

1.1 病例资料

患者,男,74岁,2019年12月9日夜间因上消化道出血伴高血压入我院急诊内科就诊。患者重度贫血貌,呼吸急促,无输血史,血常规检查白细胞计数7.44×109/L,红细胞1.42×1012/L,血红蛋白42 g/L,血小板计数68×109/L。因患者血色素过低,夜班医生申请输红细胞400 ml,输血前进行常规血型血清学检测中发现ABO正反定型不符,正定型为抗-A混合视野,反定型B细胞4+,抗体筛查阴性。

1.2 试剂与仪器

凝聚胺试剂为珠海贝索公司生产;ABO、Rh(D)血型定型检测卡(微柱凝胶法)、低离子抗人球蛋白卡(微柱凝胶法)均为瑞士DiaMedGmbH生产;抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)、抗-A1,抗-H、抗-AB试剂、RhD(IgM)血型定型试剂、抗人球蛋白(抗IgG,C3d)检测试剂、人ABO血型反定型用红细胞试剂、抗体筛选红细胞检测试剂(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)均为上海血液生物有限责任公司生产;用于配制红细胞悬液的生理盐水为山东华鲁制药有限公司生产;Diamed-ID定速离心机、Diamed-ID 37 ℃孵育器为瑞士达亚美公司生产;三用电热恒温水浴箱为常州翔天试验仪器厂生产;KA-2200型离心机为日本久保田生产。

1.3 方法

1.3.1 血型正反鉴定试验 采用微柱凝胶正反定型血型法进行检测,后又采用试管法复查。试管法正定型加做抗-A1和抗-AB,反定型做ABO试剂红细胞和自身对照,所有操作均严格按照标准操作规程[1]进行。

1.3.2 H抗原检测 取玻璃试管一支,加入抗-H试剂和3%受检者红细胞悬液各1滴,3 400 r/min离心15 s,观察结果。同时取新鲜成人B型红细胞和O型红细胞做强阳性和弱阳性对照,根据各血型红细胞H抗原强度由强到弱依次为O型>A2型>B型>A2B型>A1型>A1B型的特点,判断被检者红细胞H抗原是否增强。

1.3.3 不规则抗体筛查试验 用抗体筛选红细胞检测试剂(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)对患者标本进行不规则抗体筛查。

1.3.4 ABO基因测序 ABO基因测序根据ISBT网站提供的ABO(ISBT 001)等位基因v1.1 171023综合结果判定(以A101为参考序列),由天津市秀鹏技术开发有限公司完成。

2 结果

2.1 血型血清学检测结果

血型血清学正定型抗-A检测结果显示:在微柱凝胶实验中可见两群细胞,在盐水介质的试管法中为混合视野(见表1)。患者血清学检测结果怀疑为ABO亚型,不能准确定型,因此需通过分子生物学方法进一步试验进行准确定型。

表1 患者血型血清学反应格局

方法 正定型反定型 抗-A抗-B抗-A1抗-AB抗-H抗-DA1cBcOc自身微柱法 mf0---4+04+00试管法 2+mf00mf2+4+04+00

mf:在微柱凝胶实验中可见两群细胞,在盐水介质的试管法中为混合视野;-:未测;0:阴性

2.2 抗体筛查和抗人球蛋白实验结果

抗体筛查、直接抗人球蛋白实验、间接抗人球蛋白实验抗体筛查实验结果均为阴性,排除ABO血型系统以外的不规则抗体;直接抗人球蛋白实验阴性,排除红细胞上黏附的自身抗体对血型正定型的干扰;间接抗人球蛋白实验阴性,排除血清中存在干扰血型反定型的因素(见表2)。

2.3 ABO血型基因检测结果

ABO基因1-7外显子测序结果显示第1-5外显子未检测到突变碱基,第6外显子第261号碱基鸟嘌呤(G)缺失,第7外显子第467号发生单个碱基替换,胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),导致第156位氨基酸改变(Pro/Leu)(见图1)。由此,ABO血型PCR-SSP分型结果证实此例患者ABO基因型为A102/O01。

表2 抗体筛查、直接抗球蛋白和间接抗球蛋白实验结果

反应条件Ps+ⅠcPs+ⅡcPs+ⅢcPc+PsPc+抗人球蛋白(抗IgG,C3d)盐水法00000凝聚胺法0000-微柱凝胶法0000-

Ps:患者血清;Pc:患者红细胞;-:未测;0:阴性

图1 ABO基因外显子6和外显子7测序结果

3 讨论

红细胞血型是指红细胞膜上特征性抗原的类型。截止到2009年,国际输血协会(ISBT)已经确认了308个特异性血型抗原,其中有270个分属于明确的30个血型系统[2]。但ABO血型仍是人类血型系统中抗原免疫原性最强的一个血型系统,因此ABO血型在输血工作中是最重要的,也是最具有临床意义的。正常情况下,ABO血型系统的抗原强度不会轻易发生改变[3]。由于红细胞血型抗原表达发生改变或血清中抗体改变,都会使血型判断困难或者判断错误,不能轻易输血[4]。

本案例中,血清学检测出混合视野(即红细胞凝集成小凝块,并被大部分游离的非凝集细胞包围[5]),首先考虑排除其他原因造成的混合视野现象,如嵌合现象、并通过健康征询排除移植史、白血病等疾病影响,患者近期无输血史,排除了输错血造成的混合视野现象。

虽然血清学怀疑为ABO亚型,但通过基因检测技术确定了上述样本为A型,基因分型为A102/O01。根据文献报道A102等位基因与A101等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C467T,Pro/Leu),两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异[6]。O01等位基因在第6外显子nt261缺失,任何一个等位基因只要是包括了这个突变,不管它别的外显子中(第4、6、7显子)什么突变,都会导致ABO基因产物——催化乙酰半乳糖或半乳糖转移到寡糖受体上的能力完全丧失。由于ABO基因的多态性,除了常见的第6、7外显子上的基因突变引起抗原减弱外,第6、7外显子以外的基因变异或转录结构以及调控区域的异常都有可能导致A抗原减弱[6]。池泉等[7]报道ABO血型抗原的合成机制受多种因素影响,不同个体间即便含有相同的等位基因或突变也可能有着不同的血清学表现。所以进一步研究这些领域的分子机制将有助于理解有相同等位基因的个体却产生不同的血清学表现。

综上所述,临床上血清学方法是血型鉴定的经典方法,适用于日常的血型定型工作。当遇到血型正反定型不一致时,不要轻易报告亚型,基因测序可以对患者血型进行基因分型,并有可能发现新的突变位点。探讨疑难血型的发生机制,是对血清学鉴定方法的有效且重要的补充。因此,在血型鉴定工作中将血清学鉴定和基因测序两种方法有效结合,对于正确鉴定血型和保证临床安全输血具有重要意义。