Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠和大鼠模型述评

陶 宁,张 杰

(1中国医科大学第一临床学院中医科,沈阳 110001;2中国医科大学附属第一医院中医科;*通讯作者,E-mail:zhangjie945@126.com)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜长期慢性炎症为基本病理改变的系统性多关节炎,其临床多表现为对称性、侵袭性小关节炎症,可累及到关节外器官,导致关节畸形和强直,但发病机制尚不明确。为深入研究RA的发病机制、病理变化、药物筛选以及免疫治疗等方面,选择合适的类风湿关节炎动物模型尤为重要。Ⅱ胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是以慢性、多发性末端关节炎,甚至关节损伤等表现为主的免疫性炎症模型,其临床表现和病理改变等方面与RA有诸多相似之处,是研究RA的金标准模型[1]。

Trentham等[2]1977年首次报道了CIA模型,该模型的发病机制包括体液免疫和细胞免疫两个方面。在体液免疫中,异种动物Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)注入动物体内后,活化B淋巴细胞产生的特异性胶原蛋白抗体在关节部位与胶原蛋白结合形成免疫复合物活化了补体系统从而产生免疫反应,其中Th1型细胞因子通过增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表达,促进抗原递呈活化巨噬细胞,在CIA的发生发展中发挥着重要作用[3-5]。然而,并非所有产生抗Ⅱ型胶原抗体的动物都出现关节炎,抗体滴度与关节炎的严重程度也并非成正比,这说明单一的体液免疫并不能完美诠释CIA的发病原因,需结合细胞免疫进行综合分析。在细胞免疫中,T细胞上的CD4分子和T细胞受体(TCR)识别与抗原片段结合的MHC分子,分泌细胞因子,促进该抗原的细胞和体液免疫反应,提示T细胞反应在CIA的发病中起重要作用,这与类风湿关节炎患者免疫学改变相似[6-8]。

目前,无论是在RA的免疫研究、新药研发与筛选还是疗效评价等方面,CIA模型都是最理想的类风湿关节炎实验动物模型[9,10]。本文阐述了影响该模型成功建立和成模率的主要因素以及需注意的问题。

1 鼠种的选择

目前,国内外CIA造模采用的实验动物多为大鼠或小鼠,其优点在于高度的遗传背景同质性、低成本和易处理。在CIA的致病能力方面,二者及其各自种系间又存在差异。不同种系小鼠对CIA的敏感度不同[7],这是因为Th1型细胞因子通过增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表达来影响CIA的发生发展[11],CIA动物的敏感性也与其特定基因MHC-Ⅱ的表达息息相关[12,13]。研究表明,MHC表现为H-2r、H-2q的单倍型小鼠对CIA易感性最强,如DBA/1(H-2q)、B10.RⅢ(H-2r)小鼠;而MHC表现H-2b、H-2d的小鼠,对关节炎胶原诱导具有相对抵抗性,属于易感性较差的品系,如C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)小鼠[12,14,15],亦可在胶原蛋白诱导下发生关节炎。因此,近交系DBA/1、C57BL/6J、BALB/c是目前国际认可的CIA模型小鼠。

DBA/1小鼠作为CIA经典模型鼠,其关节炎程度较重,出现滑膜炎、软骨和骨侵蚀等类似于人RA的病理变化,成模率高达90%-100%,且关节炎症状表现及严重程度差异性小[15,16],尽管存在价格昂贵、饲养条件要求高、临床表现持续时间较短等缺点,但DBA/1小鼠仍是CIA实验动物的佳选;C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠,均属于不易感品系,其中C57BL/6品系对鸡Ⅱ型胶原可产生强烈且持续的T细胞反应而引发关节炎,常规造模方法成模率可达50%-70%,但有文献指出改进免疫方法即基础免疫后第21天在其后足(替代尾根部)注射胶原乳剂,其成模率可提高到100%。C57BL/6(H-2b)小鼠的优点在于其炎症持续时间较DBA/1小鼠更长,且大多数转基因和基因敲除的小鼠都是在其背景上实践的,更适合作为类风湿关节炎发生机制研究和药物开发的动物模型[17,18]。不足之处在于C57BL/6鼠种关节炎表现仅在后足,肿胀程度差异性较大,且性情暴躁,易造成动物死亡和实验人员受伤,影响实验结果。BALB/c鼠作为CIA实验动物的研究较少,有文献指出该鼠造模具有重现性好、周期短、经济实用、成模率较高等优点[19],但实验例数较少,其准确性有待进一步证实。

大鼠受MHC基因类型的影响较小,具有较广的种系范围,如远交系DA大鼠、SD和Wistar大鼠、近交系Lewis大鼠等。其中远交群SD和Wistar大鼠因其适应力强,繁殖快,足爪红肿明显,关节畸形,软骨表面较明显破坏,慢性病程,治疗耗时长(连续观察21周)等与RA相似的特点被国内高频率应用[8,20],但大鼠的实际成模率不如小鼠,始终未达到100%成模。

2 鼠龄的选择

据统计,在人类RA患者中,40-65岁为高发年龄段,提示年龄在RA的发生发展过程中的影响存在差异。在动物实验中,小鼠应至少7-8周龄才易被诱导产生关节炎,因为此时的小鼠才具有成熟免疫系统[21]。以常用的高敏感性DBA/1小鼠为例,要达到90%-100%的高成模率,一般选6-8周龄;低敏感性的以C57BL/6小鼠为例,其在12-14周龄会有50%-60%较高成模率[22,23]。老年小鼠亦可用于造模,但其发病率和严重程度均不佳。在大鼠方面,幼年大鼠明显较老年大鼠更容易诱发关节炎。以常用的Wistar大鼠和SD大鼠为例,研究表明4-5周龄Wistar大鼠建模成功率达83.3%[8],6周龄Wistar大鼠CIA造模成功率可达92%[24]。4周龄SD大鼠成模率可达90%[20],5-6周龄SD大鼠的成模率约为75%[25]。由此可见,鼠龄对CIA模型的成模率有重要影响。

3 性别的选择

在临床中,女性RA患病率约为男性患者的4倍[26]。在动物实验中,雌性大鼠较雄性更容易诱导关节炎[8],这一点也与人体RA的男女患病比率相似;而在小鼠中,最新文献[27,28]提示雄性小鼠具有较高的胶原蛋白性关节炎易感性,其发病率和严重程度均高于雌性小鼠,高应答品系DBA/1、B10.RⅢ雄性小鼠的CIA成模率可达90%-100%,分析其原因可能有以下两方面:一是高浓度的雌激素可抑制细胞介导的免疫反应,雌激素的代谢产物亦可降低滑膜组织的炎性程度[29],提示雌性鼠CIA成模率较低可能与其体内较多的雌激素有抑制关节炎的作用有关;二是雄鼠之间的互相攻击会增加其对CIA的易感性,并且对严重的自发性肌腱附着点病变的发展具有促进作用[30]。但雄鼠间过度打斗的致伤、致残、致死会影响实验结果的准确性,实验中应当避免此类情况发生。以上均说明性别差异会影响造模成功率。此外,另有研究表明低应答品系C57BL/6小鼠应用于CIA造模时雌雄小鼠的发病率和严发重程度差异不明显,其中雌性小鼠占46%,雄性小鼠占54%,提示该鼠性别的差异对于CIA模型成模率的影响较小,可忽略不计[23]。

4 CⅡ来源及浓度的选择

不同来源的CⅡ会造成鼠对其免疫应答及关节炎发展方面的差异。对于小鼠而言,即使易感性高的DBA/1和B10.RⅢ小鼠用同源性的Ⅱ型胶原免疫,其CIA发病率仍然非常低(约10%)[31]。而对于大鼠,自体大鼠CⅡ可用来免疫大鼠诱导关节炎模型[2]。因此,诱导大鼠的CIA,选同源或异源性Ⅱ型胶原均可;而诱导小鼠的CIA,则仅可选用异源性CⅡ(如牛、鸡、猪源)诱导关节炎[32-34]。一般说来,猪源性CⅡ中最易诱发关节炎,其次是牛源性CⅡ,鸡源性CⅡ致炎效果最差[35]。然而,不同品系小鼠对来源性CⅡ的敏感度存在差异,如DBA/1小鼠对鸡、牛、猪和人源性CⅡ都具有高敏感性,大鼠与DBA/1小鼠相似,对人源性CⅡ敏感度稍差;B10.RⅢ小鼠对牛和猪源性CⅡ有强反应,但对鸡型和人源性CⅡ的反应较差[15,35];而易感性差的C57BL/6小鼠对鸡源性CⅡ有强烈的免疫应答[17]。在CIA造模实验中,高成模率的DBA/1小鼠通常选择鸡或牛源性CⅡ,具有CIA抗性的C57BL/6小鼠则选鸡源性CⅡ,这两种CⅡ在大鼠造模中均被高频率应用。

除了CⅡ的来源不同会影响鼠成模率,CⅡ的浓度也是影响鼠CIA高成模率的关键。经研究发现,采用同种CⅡ造模,其发病率也会因其浓度的不同而异,高浓度CⅡ免疫的大鼠发病率更高[27]。因此,只有CⅡ达到一定浓度时,才能诱导T细胞,激发其对自身CⅡ的免疫反应而诱发关节炎。相关文献[16,22]提示高应答品系小鼠的成模率高达90%-100%,注射胶原的浓度为2 mg/ml;低应答品系小鼠的成模率为50%-70%,注射胶原的浓度为2.5 mg/ml。但需注意的是当CⅡ浓度过大时,可能会引起实验动物关节部位严重的炎症反应,影响实验的顺利进行。因此在配制乳剂时,应根据实际情况选择合适浓度的CⅡ。

5 佐剂的种类与浓度的选择

佐剂分为弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)和弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)两种,佐剂的选择及其浓度的大小直接影响着CIA的发病率。两种佐剂均为淡黄色透明溶液,二者区别的关键在于CFA含有结核分枝杆菌的细胞壁成分,该成分能有效地诱导产生高滴度抗体,加强对抗原的抗体反应。补体的激活须有抗原抗体复合物的参与,诱导关节炎的重要步骤正是激活补体系统;而IFA只含有矿物油成分,仅可协助抗原刺激机体产生抗体应答,一般用于加强免疫[36]。因此CFA与CⅡ乳化后免疫的小鼠能更迅速地诱发为严重的关节病变,如滑膜增生、单核细胞浸润、软骨降解等[37,38]。小鼠第0天进行首次免疫应选择CⅡ与CFA充分乳化,第21天进行加强免疫时则可根据小鼠的状态选择CⅡ与CFA或IFA乳化,大鼠免疫所选择的佐剂与小鼠相同[39,40]。两次免疫均用CFA时,小鼠可能会出现强烈的炎症反应,考虑小鼠品系及发病率的问题,敏感性高的小鼠加强免疫一般可采用IFA加强免疫,敏感性低的小鼠则考虑继续采用等剂量CFA。

确定两次免疫所需的佐剂之后,其次确定的就是佐剂的浓度。低应答小鼠品系以C57BL/6为例,常规免疫方法要达到60%左右的高发病率时,每只鼠注射的胶原乳剂中CFA的浓度为5 mg/ml[14-18];对于高应答品系,如DBA/1小鼠,发病率要达到90%-100%时,每只鼠注射的混合乳剂中CFA的浓度为4 mg/ml[21,22]。值得注意的是佐剂浓度偏高时可能导致注射部位溃烂,甚至实验动物死亡。

6 实验操作过程

准确而严谨的实验过程及操作是CIA模型成功建立和高成模率的基础。以小鼠为例,在无菌避光条件下,将CⅡ(鸡或牛)粉末溶解于0.02 mol/L冰醋酸溶液中,使其形成终浓度为2 mg/ml的溶液,研磨搅拌均匀置于4 ℃冰箱过夜,第2天在相同条件下,将CⅡ溶液与等体积的浓度为4 mg/ml的CFA溶液在冰上充分混合乳化形成白色乳剂。第0天每只小鼠于靠近尾根部约1-2 cm处两点或多点皮内注射0.15 ml乳剂进行初次免疫,第21天以同样的方法进行加强免疫,每只小鼠注射0.1 ml,该乳剂-80 ℃可保存1周,若二次免疫后CIA模型未成,可继用本次配好的乳剂再补一次免疫[21,32]。大鼠的操作过程与小鼠大致相同,需根据大鼠的体重调整注射剂量。在造模操作过程中,还有以下三点需要特殊注意。

6.1 Ⅱ型胶原的保存

除了选择适合的Ⅱ型胶原蛋白,正确的保存方法也是CIA高成模率的关键。文献指出CⅡ是一种无色透明的溶液,应置于-4 ℃黑暗的条件下短期保存,保存时间为2个月以上者,应避光保存于-20 ℃冰箱中[22,41]。液体若出现浑浊,则表明它可能已经交联沉淀,或者受到污染,变性的CⅡ将难以形成乳剂而致小鼠、大鼠CIA不成模或成模率极低。建议将胶原蛋白溶液以小等份试样的方式储存,以便解冻所需的实验量,变性的胶原应弃之勿用。

6.2 乳化的条件

乳化的是否充分直接影响CIA造模的成功率。首先,保持CⅡ的抗原特性是至关重要的一步。酸性溶液中的冻干胶原蛋白和胶原蛋白溶液在-20 ℃下黑暗中稳定,新配制的胶原蛋白溶液可以在4 ℃保持一周,但之后应密封保存在-20 ℃。其次,选用乳化的方法也尤为重要。通常有以下3种:①研磨法是将等体积抗原与佐剂分别研磨后加入冰浴研钵中不断研磨,直至溶液成白色乳滴状。此法适用于大批量乳剂的制备,虽然乳化比较完全,DBA/1小鼠成模率可达100%[42,43],但形成黏稠的乳化物会大量地附着在研钵壁上,乳剂回收率较低,且乳化时间需要2 h左右,耗时耗力。此外,根据个人造模经验,在单独研磨胶原溶液时,由于室内湿度温度的影响可能出现胶原内液体蒸发现象而导致乳剂制备失败。②注射器混合法利用橡皮管将两个5 ml注射器连接在一起作为乳化的工具,将抗原和佐剂在冰浴环境中进行互推,反复抽吸,直至形成白色乳剂[15]。此法适用于小剂量乳剂的制备,虽然避免了研磨法可能出现抗原液体蒸发的情况,也解决了乳剂回收问题,但乳化过程耗时费力,且难以乳化完全又不稳定。③超声匀浆法操作简便快捷,但产热较大,且超声会将胶原分成多个片段,而小片段胶原在正常体温下易变性,结果较不理[33,38]。

据文献提示,电动搅拌器被强烈推荐用于胶原乳剂的制备[41]。中山大学黄小荣等[44]的实验室在电动搅拌器的基础上进行整合改进,研究出了一种省时省力又避免胶原浪费的胶原乳化的方法,即电动佐剂搅拌器与注射器结合法。将抗原和弗氏佐剂加入30 ml针筒中,再用电动佐剂搅拌棒进行混合乳化。该法不但有效地规避了以上几种方法的弊端,而且效率高,便于操作、清洗和消毒,乳剂可充分乳化且回收率高,值得借鉴学习。

6.3 注射部位及方法

大量文献[8,12,14,16,22,39,45]提示,CIA造模选取注射的部位为鼠的尾根部。背部注射也能诱导关节炎,但需要更多胶原乳剂;腹腔注射乳剂时,胸膜和腹膜会发生强烈的炎症反应,因此不建议采用这两种注射部位[46]。鼠的毛比较茂密,为了方便操作,注射前须剃掉尾根部周围的毛,勿损伤小鼠皮肤。乳剂应保证注射到皮肤内浅表部位,并维持在小鼠尾根部皮内区域,不应在其体内移动,注意避免刺入尾根部附近的脏器组织。注射的位置不当会导致尾根部皮肤溃烂严重甚至脱落且成模率低,若不慎将乳液注入尾静脉,则会导致小鼠迅速死亡[41]。

目前,CIA造模常用注射方式有两种,即皮下注射和皮内注射[47-49]。皮下注射是指将乳剂注射到皮下组织,即浅筋膜,位于皮肤与深筋膜之间,由疏松结缔组织和脂肪组织构成。该方法虽操作和进针较容易,可注射较多液体,但不能精确地定位药物作用的部位且吸收快;皮内注射是指将乳剂注射到表皮和真皮之间,真皮为含有大量纤维成分的致密结缔组织。本法操作和进针较皮下注射困难且药物的注射量较少,但乳剂可主要集中于注射部位,定位较准确,并且吸收速度较慢,可以对机体产生较为长久的刺激,促使机体对刺激产生反应。综上,两种方法虽然均有利弊,但结合文献及CIA造模的成功率,皮内注射为最佳选择。

7 结语

目前,国内外已探究多种动物模型用于RA病因以及发病机制的研究,包括佐剂诱导关节炎、链球菌细胞壁(SCW)诱导关节炎、K/BxN小鼠模型等。与之相比,CIA虽制备方法较古老,但以其高度可重复性以及可操作性的优势,仍是RA临床和基础研究中最经典、最理想的实验动物模型,为RA寻找新的治疗靶点及新药的验证,更好地转化为临床应用,提供了宝贵的实验及理论基础。本述评为了各实验室能够进行高效且成功的CIA小鼠和大鼠造模实验,详细地评述了该模型在建模过程中材料的选择以及操作过程,将实验中的细节进行量化、规范化,避免实际操作中因失误所导致的造模失败,以期对相关领域研究者的基础实验提供借鉴。