基于多齿功能单体的三聚氰胺印迹材料的制备及应用

王晓如, 张 娜,2, 邢 钧

(1. 武汉大学化学与分子科学学院, 武汉 430072;2. 东阳光药业股份有限公司质量研究室, 宜都 443300)

三聚氰胺(MEL)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物, 由于其含氮量高, 曾被一些不法商家作为添加剂加入到奶制品中以提高其表观蛋白含量[1～3]. 然而, 当三聚氰胺被摄入生物体内后会形成肾结石、尿结石, 并导致肾衰竭、膀胱癌甚至死亡[4～7]. 因此, 联合国食品标准委员会为奶制品中的三聚氰胺含量设定了限量标准[8], 规定婴幼儿配方奶粉中的限量值为1 mg/kg, 液态奶(包括原料乳)和奶粉等产品中的限量值为2.5 mg/kg. 由于奶制品基质复杂且三聚氰胺含量较低, 所以研究人员尝试利用分子印迹材料来改善分离的选择性, 但实际效果并不理想, 如以甲基丙烯酸为功能单体合成的三聚氰胺印迹材料的选择性系数(以三聚氰酸为对照物)通常均小于2.05[9]. 因此, 如何改善分子印迹材料的选择性仍然是一个值得研究的重要内容.

印迹聚合物(MIP)对目标物的高选择性一方面来源于印迹聚合物孔穴与目标物分子在形状上的互补性, 另一方面则来源于印迹孔穴中识别位点分布的特异性[10～16]. 对于非共价印迹方式而言, 只有当功能单体/模板分子复合物在聚合物合成过程中保持稳定, 才能使印迹孔穴中识别位点的分布具有特异性, 因此, 功能单体/模板分子复合物的稳定性应该对印迹材料的选择性有重要影响. 虽然尚未见有关分子印迹的报道可以佐证这一观点, 但Xing等[17]在研究Cu2+印迹材料(Cu2+-IIP)时发现, 功能单体/金属离子配合物的稳定性对IIP的选择性有显著影响, 而且采用多齿功能单体(EDTA的类似物)可显著改善IIP的选择性. 尽管有关分子印迹的研究报道很多, 但极少涉及多齿功能单体. 王岩等[18]采用量子化学密度泛函理论的长程校正方法, 模拟并探讨了三聚氰胺与功能单体的相互作用, 进而推算出三聚氰胺与衣康酸的最佳摩尔比为1∶6, 但所合成材料的选择因子仅为1.53(以三聚氰酸为对照物). 其它研究则未详细讨论印迹材料的选择性: 如以衣康酸为功能单体合成印迹液相色谱固定相[19]; 以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸盐为功能单体的磁性分离材料[20]; 以烯丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-(1H,3H,5H) 三酮为功能单体, 在表面等离子体共振(SPR)传感芯片上合成分子印迹聚合物薄膜等[21].

为了探索改善分子印迹材料选择性的方法, 本文选用衣康酸为多齿功能单体, 以三聚氰胺为模板分子, 采用沉淀聚合的方法研究了模板分子、功能单体以及交联剂之间的配比对MIP选择性的影响, 并考察了其吸附性能及选择性. 以所合成的MIP为吸附剂, 建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱(MISPE-HPLC/UV)法用于检测牛奶和奶粉中的三聚氰胺.

衣康酸(IA)、三聚氰胺(MEL)、灭蝇胺(CYR)及三聚氰酸(CYA)的分子结构见Scheme 1.

Scheme 1 Molecular structures of IA, MEL, CYR and CYA

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙腈、乙酸和氨水均为分析纯, 购于上海国药集团化学试剂有限公司; 三聚氰胺(MEL, 纯度>99.0%)购于上海国药集团化学试剂有限公司; 衣康酸(IA, 分析纯)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA, 纯度98%)和偶氮二异丁腈(AIBN, 纯度98%)购于阿拉丁试剂有限公司, AIBN使用前在乙醇中进行重结晶处理; 磷酸二氢钠(分析纯)购于上海展云化工有限公司; 灭蝇胺(CYR, 纯度>98%)购于Adamas公司; 三聚氰酸(CYA, 纯度99%)购于上海安谱科学仪器有限公司; 甲醇(色谱纯)购于上海星可高纯溶剂有限公司; 牛奶与奶粉购于武汉大学珞珈自强超市.

Heal Force Easy型超纯水仪(香港力康生物医疗科技控股有限公司); AL104型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司); SHA-B(A)型双功能水浴恒温振荡器(江苏省金坛市鸿科仪器厂); TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂); BF-2000型氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司); NEXUS670型傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司); Zeiss Sigma型高分辨场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司公司).

采用日本岛津公司SPD-20A型高效液相色谱仪(配有紫外检测器)测定三聚氰胺含量. 色谱条件参照文献[22]并做适当修改: SUPELCOSILTMLC-CN色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，柱温30 ℃, 进样量20 μL. 测试选择性时, 流动相为5 mmol/L磷酸二氢钠/甲醇混合溶液(体积比80∶20, pH=5.5), 流速1 mL/min, 检测波长220 nm; 进行其它检测时流动相为5 mmol/L磷酸二氢钠/甲醇混合溶液(体积比80∶20, pH=3.0), 流速1 mL/min, 检测波长240 nm.

三聚氰胺、灭蝇胺和三聚氰酸储备液的配制: 准确称取10.0 mg样品分别溶于甲醇/水混合溶液(体积比1∶1)中, 定容至10 mL, 即得1000 mg/L储备液. 存放于冰箱中备用, 使用时用乙腈稀释至所需浓度.

1.2 MIP和NIP的合成

以MEL为模板分子, IA为功能单体, EGDMA为交联剂, 采用沉淀聚合法制备了三聚氰胺分子印迹聚合物(MIP), 其合成路线见Scheme 2.

Scheme 2 Synthetic route of melamine imprinted polymer

MIP的合成: 称取630.6 mg(5.0 mmol) MEL置于250 mL三颈圆底烧瓶中, 加入170 mL甲醇/水混合溶液(体积比15∶2), 搅拌溶解后加入975.8 mg(7.5 mmol) IA, 继续搅拌15 min, 依次加入5.9 g(30 mmol) EGDMA和82.1 mg AIBN, 搅拌下通氮气除氧10 min, 在氮气氛围下升温至60 ℃反应 24 h. 抽滤, 用大量甲醇多次洗涤所得聚合物以除去未反应的单体, 将聚合物在60 ℃下干燥过夜.

去除模板分子: 将MIP(1 g)置于150 mL锥形瓶中, 加入50 mL甲醇/乙酸混合溶液(体积比7∶3), 于50 ℃持续振荡, 每隔2 h换一次溶剂, 直至清液中检测不到三聚氰胺. 然后, 依次用甲醇、水、甲醇洗涤聚合物以除去残留的乙酸. 最后, 在60 ℃下将聚合物真空干燥24 h.

除不加入模板分子外, 非印迹聚合物(NIP)的制备过程与MIP的制备过程相同.

1.3 吸附性能测试

1.3.1 静态吸附实验 分别称取20.0 mg MIP和NIP置于25 mL锥形瓶中, 各加入5 mL浓度分别为1, 5, 10, 20, 40, 60, 80及100 mg/L的MEL标准溶液, 室温下放入水浴恒温振荡24 h. 取上层清液用0.22 μm针式滤头过滤, 采用HPLC/UV测定溶液中剩余的MEL浓度, 并用下式计算吸附容量Q(mg/g):

(1)

式中:c0和ce(mg/L)分别为样品溶液中三聚氰胺的初始浓度和平衡后的浓度;V(L)为所用溶液的体积;m(g)为吸附剂(MIP或NIP)的质量.

1.3.2 动态吸附实验 分别称取20.0 mg MIP和NIP置于25 mL锥形瓶中, 各加入5 mL 浓度为10 mg/L 的三聚氰胺标准溶液, 室温下水浴恒温振荡150 min, 间隔一定时间取样, 上层清液经0.22 μm针式滤头过滤后, 用HPLC/UV测定样品溶液中MEL的浓度.

1.4 选择性测试

1.4.1 非竞争条件下的吸附选择性 分别以灭蝇胺和三聚氰酸为对照物, 在非竞争条件下测定了MIP和NIP对三聚氰胺的选择性. 分别取5 mL 浓度均为10 mg/L 的三聚氰胺、灭蝇胺和三聚氰酸标准溶液置于25 mL锥形瓶中, 室温下将20.0 mg MIP或NIP分别加入各溶液中, 水浴恒温振荡1 h, 将上层清液用0.22 μm针式滤头过滤后, 用HPLC/UV分别测定溶液中剩余的三聚氰胺、灭蝇胺和三聚氰酸的浓度, 并用下式计算吸附容量(Q)、分配系数(KD, L/g)和选择性系数(k):

KD=Q/ce

(2)

k=KD,MEL/KD,Control

(3)

式中:KD, MEL和KD, Control分别为MEL和对照物的分配系数.

1.4.2 竞争条件下的吸附选择性 分别称取20.0 mg MIP和NIP置于25 mL锥形瓶中, 各加入5 mL三聚氰胺和灭蝇胺的混合溶液(浓度均为10 mg/L), 室温下水浴恒温振荡1 h, 将上层清液用0.22 μm针式滤头过滤, 用HPLC/UV测定溶液中剩余的三聚氰胺和灭蝇胺浓度, 并计算吸附容量(Q)、分配系数(KD)和选择性系数(k).

1.5 MISPE固相萃取小柱的制备

在5 mL一次性塑料注射器底部放置1个聚乙烯筛板, 称取150.0 mg MIP吸附剂置于注射器中, 轻轻敲打注射器底部使吸附剂填充均匀且上表面平整, 然后在材料表面放置1个聚乙烯筛板, 用玻璃棒轻轻压实, 制得MISPE固相萃取小柱.

1.6 固相萃取过程

萃取前, 依次用3 mL水和3 mL乙腈活化MISPE小柱. 取2 mL样品溶液(三聚氰胺的乙腈溶液)上样, 流速为1 mL/min. 用3 mL乙腈清洗MISPE小柱后, 用4 mL甲醇/氨水混合溶液(体积比4∶1)进行洗脱. 在45 ℃下用氮气将洗脱液吹干后, 加入0.2 mL甲醇复溶, 经0.22 μm针式滤头过滤后用于HPLC/UV检测.

1.7 牛奶和奶粉样品的制备

牛奶和奶粉样品的制备参照文献[23]方法并做适当修改: 将2.0 mL牛奶或2.0 g奶粉样品置于10 mL具塞刻度管中, 加入6 mL乙腈, 超声萃取20 min, 用乙腈定容至10 mL. 用一次性注射器吸取4 mL待测溶液, 用0.22 μm针式滤头过滤, 取2 mL所得滤液用于MISPE萃取操作.

2 结果与讨论

2.1 合成条件的优化

采用沉淀聚合的方法, 以三聚氰胺为模板分子, 合成了模板分子(MEL)、功能单体(IA)及交联剂(EGDMA)之间摩尔比不同的8种分子印迹聚合物, 产物依次命名为MIP1～MIP8, 具体配比见表1. 以灭蝇胺为对照物, 利用三聚氰胺和灭蝇胺混合溶液(10 mg/L)测定了这些MIP的吸附容量(Q)、印迹因子(IF)和选择系数(k), 实验结果示于表1.

Table 1 Performance of MIPs under different synthetic conditions

* IF(imprinted factor) =QMIP/QNIP.

由表1可见, 当IA/EGDMA摩尔比固定不变, MEL/IA摩尔比为1∶1.5时, 印迹聚合物的吸附容量、选择系数及印迹因子最大, 即所合成的印迹聚合物的性能最好. 值得注意的是, 此时功能单体(IA)的识别位点(羧基)数与模板分子(MEL)的可识别位点(胺基)数之比恰好为1∶1, 即所有的功能单体均参与了模板分子的自组装, 因此理论上不存在过量功能单体引起的非特异性吸附. 根据已有报道[24,25]可知, MAA是目前合成三聚氰胺印迹材料最常用的功能单体, 优化后的MEL/MAA的摩尔比通常为1∶4～1∶32. 由于每个三聚氰胺分子有3个可识别位点(胺基), 而甲基丙烯酸仅提供1个识别位点(羧基), 因此, 即使以MEL/MAA的最低摩尔比(1∶4)计, 甲基丙烯酸仍过量约30%. 由于过量的功能单体难免存在于印迹聚合物表面, 必然导致非特异性吸附, 进而导致表观选择性下降, 因此, 过量的功能单体可能是现有三聚氰胺印迹材料选择性不太理想的原因之一.

表1数据还显示, 当MEL/IA摩尔比为1∶1.5且IA/EGDMA摩尔比为1∶4 时, 所合成的印迹聚合物性能最优. 综上所述, 合成方案中MEL/IA/EGDMA最佳摩尔比为2∶ 3∶12. 后续研究将以依照该摩尔比重新合成的印迹材料为MIP进行实验.

2.2 MIP和NIP的红外光谱及形貌表征

Fig.1 FTIR spectra(A) and SEM images of MIP(B) and NIP(C)

2.3 MIP和NIP的吸附性能评价

2.3.1 吸附等温线的测定和Scatchard分析 实验中测试了MIP和NIP的等温吸附性能, 结果示于图2(A). 可见, MIP的吸附容量随着三聚氰胺溶液初始浓度的增大而增大, 且其吸附容量大于NIP的吸附容量, 当初始浓度为100 mg/L时, MIP的吸附容量为NIP吸附容量的3.5倍. 因此, 所合成的MIP具有良好的印迹效果. 采用Scatchard方程[26]对MIP和NIP的等温吸附实验数据进行处理, 以Q/ce对Q作图并进行了线性拟合, 结果见图2(B)和(C). Scatchard方程的表达式如下:

(4)

式中:Kd(L/mg)为离解平衡常数;Qmax(mg/g)为最大表观吸附容量.

Fig.2 Binding isotherms(A) and scatchard analysisof MIP(B) and NIP(C)

MIP的Scatchard方程为Q/ce=-0.073Q+0.171,R2=0.982, 计算得到MIP的解离平衡常数Kd=13.70 L/mg, 最大表观吸附容量Qmax=2.34 mg/g; NIP的Scatchard方程为Q/ce= -0.070Q+ 0.047,R2=0.989,Kd=14.29 L/mg,Qmax=0.67 mg/g.

值得注意的是, 当三聚氰胺浓度在1～100 mg/L范围内时, 采用衣康酸合成的MIP对三聚氰胺只存在特异性结合, 而现有文献[24,26～28]报道均显示存在特异性和非特异性2种吸附特性. 产生这种差异的原因并非测定方法不合理, 而是印迹材料的化学组成显著不同. 首先, 由表2可知, 从MIP用量(mMIP)、三聚氰胺溶液的浓度范围(c)及用量(V)等方面看, 本文方法与文献基本一致. 而且当三聚氰胺浓度为100 mg/L时, 溶液中三聚氰胺总量已超过本文MIP表观最大吸附能力的10倍, 因此本文采用的实验方法合理. 其次, 由表2中三聚氰胺的胺基与功能单体的羧基的摩尔比可以看出, 本文所采用的胺基与羧基的摩尔比恰好为1∶1是最低的, 因此, 理论上不存在过量的识别基团, 也就不存在由此产生的非特异性吸附, 这很可能就是在常规测试浓度范围内本文合成的MIP仅显示一种吸附特性的原因. 综上所述, Scatchard分析结果表明, 由于本文合成的MIP中没有过量的功能单体, 因此能够在相对更宽的浓度范围内仅表现出对三聚氰胺的特异性吸附.

Table2 Comparison of binding characteristics and affinity of MIP towards melamine

a. Molar ratio of amino groups in template to carboxyl groups in functional monomer;b.m=cmax×V;c.m′=Qmax×mMIP.

Fig.3 Kinetic adsorption isotherms of MIP and NIP

2.3.2 动力学吸附性能 MIP和NIP的动力学吸附曲线示于图3, 可见, 吸附60 min 时MIP和NIP均能达到对三聚氰胺的萃取平衡, 因此, 在静态萃取实验中选取60 min作为萃取时间. 由于采用沉淀聚合法时部分印迹孔穴位于聚合物颗粒的内部, 因此, 平衡时间明显大于表面印迹材料[29,30]. 此外, 由图3还可见, 达到萃取平衡时MIP的萃取量约为NIP的3倍, 该结果表明所合成的MIP具有良好的印迹效果.

2.4 选择性评价

2.4.1 非竞争条件下的吸附选择性 实验测得的非竞争条件下MIP和NIP对MEL的选择性结果列于表3.

Table 3 Selectivity factors of MIP and NIP to MEL(non-competition)

由表3可见, 以灭蝇胺为对照物时, MIP对三聚氰胺的选择性系数为3.28; 以三聚氰酸为对照物时, MIP对三聚氰胺的选择性系数高达10.41. 目前, 多数研究[28,31,32]的考察重点是印迹与非印迹材料在萃取量上的差别, 仅几篇文献仔细考察了印迹材料的选择性, 相关数据见表4.

Table 4 Comparison of selectivity factors of MIP to MEL

a. Pseudo template, 2-(4,6-diamino-1,3,5-triazin-2-ylamino)ethanethiol disulfide;b. 9-vinylcarbazole.

由表4可见, 当以三聚氰酸为对照物时, 以衣康酸为功能单体合成的MIP对三聚氰胺的选择性远高于文献数据, 因此, 可以认为基于多齿功能单体衣康酸制备的MIP在选择性方面具有显著优势.

2.4.2 竞争条件下的吸附选择性 由于所合成的MIP是利用衣康酸的羧基与三聚氰胺的胺基间的识别作用, 而灭蝇胺(CYR)中含有1个环丙基取代的胺基, 其碱性更强但分子形状上与三聚氰胺差别较大, 因此, 本文以CYR为对照物, 测定了竞争条件下MIP和NIP对MEL的选择性, 结果见表5.

Table 5 Selectivity factors of MIP and NIP using mixed solution of MEL(10 mg/L) and CYR(10 mg/L)

由表5可知, 在三聚氰胺/灭蝇胺混合溶液中, MIP对二者的吸附量均大于NIP, 此结果再次证明所合成的MIP具有良好的印迹效果. 另一方面, 由于CYR的碱性强于MEL, 因此很好理解kNIP<1, 即NIP对CYR的吸附能力强于对MEL的吸附能力. 但值得注意的是, 即使在有竞争条件下kMIP却转变为大于1, 即MIP对MEL的吸附能力强于对CYR的吸附能力. 因此, 采用衣康酸作为功能单体时MIP对分子形状也具有良好的识别能力. 目前尚未见有关类似测试的报道.

2.5 MIP的应用

将MIP用作SPE吸附剂, 按照1.5节方法填装成固相萃取小柱(MISPE), 建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱(MISPE-HPLC/UV)方法, 用于对三聚氰胺进行定量分析. 为了获得最佳的富集效果, 以浓度为1 mg/L的三聚氰胺溶液为样品, 对上样溶剂、清洗溶剂以及洗脱溶剂的种类等MISPE操作条件进行了优化.

2.5.1 上样溶剂的选择 以三聚氰胺的绝对回收率为依据, 考察了分别以甲醇、乙醇和乙腈作为上样溶剂时对MISPE的影响, 实验结果见图4(A). 结果表明, 不同溶剂上样的回收率均高于90%. 考虑到沉淀牛奶样品蛋白所用的溶剂为乙腈, 故选择乙腈作为上样溶剂.

2.5.2 清洗溶剂的选择 在MISPE过程中, 清洗步骤有可能带来目标物的损失, 故分别以甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷作为清洗溶剂, 考察了清洗溶剂对三聚氰胺绝对回收率的影响, 实验结果示于图4(B). 可见, 以乙腈、丙酮和二氯甲烷作为清洗溶剂时三聚氰胺的绝对回收率均高于90%, 其中以乙腈作为清洗溶剂时的回收率最高, 近乎为100%, 故选择乙腈作为清洗溶剂.

2.5.3 洗脱溶剂的选择 考察了甲醇/乙酸(体积比8∶2)、甲醇/乙酸(体积比9∶1)、甲醇/氨水(体积比8∶2)和甲醇/氨水(体积比9∶1)混合溶液作为洗脱溶剂时对三聚氰胺的绝对回收率的影响, 结果示于图4(C). 可见, 当以甲醇/氨水(体积比8∶2)混合溶液作为洗脱溶剂时, 三聚氰胺的绝对回收率最大, 故选择甲醇/氨水(体积比8∶2)混合溶液作为MISPE的洗脱溶剂.

Fig.4 Optimization of MISPE conditions: loading solvent(A), washing solvent(B) and eluting solvent(C) (C) Elution sovent: a. Vmethanol∶ Vacetic acid=8∶2; b. Vmethanol∶ Vacetic acid=9∶1; c. Vmethanol∶ VNH3·H2O=8∶2; d. Vmethanol∶ VNH3·H2O=9∶1.

2.5.4 分析方法的评价 将MEL储备液用乙腈稀释成浓度分别为1, 5, 50, 100, 500和1000 μg/L的标准溶液, 在最优条件下考察了MISPE-HPLC/UV方法的线性范围、检出限和重现性. 实验结果表明, 在1～1000 μg/L浓度范围内该方法具有良好的线性关系, 线性回归方程为y=210.790x+1999.557(R2=0.999), 检出限(S/N=3)为0.3 μg/L, 定量限(S/N=10)为1.0 μg/L. 为了评估该方法的重现性, 以浓度为1000 μg/L的三聚氰胺标准溶液评价了测定结果的重现性, 日内和日间测试结果的相对标准偏差(RSD,n=3)分别为1.0%和5.2%.

将本文方法与文献[22,34～37]报道的基于三聚氰胺分子印迹聚合物的方法进行了比较, 由表6可见, 本文方法具有线性范围宽且检出限低等特点.

Table 6 Comparison with previous methods based on molecularly imprinting technology

a. Molecular imprinted stir bar sorptive extraction;b. magnetic molecularly imprinted solid-phase extraction;c. molecular imprinted dispersive extraction.

2.6 实际样品分析

采用本文方法对牛奶和奶粉样品的测定结果表明, 在所购买的牛奶和奶粉中均未检测到MEL. 为了考察该方法的准确性, 分别在牛奶和奶粉样品中添加20 μL不同浓度的MEL标准溶液, 按照实验方法进行处理并测定了加标回收率, 测定结果见表7. 图5为空白样品以及加标浓度为600 μg/L的牛奶样品、加标浓度为4500 μg/kg的奶粉样品的色谱图. 由表7可见, 3个浓度的加标回收率在92.34%～109.4%之间, RSD均低于6.5%. 由此可见, 该方法可用于测定牛奶和奶粉中三聚氰胺的浓度.

Fig.5 MISPE-HPLC/UV chromatograms of milk spikedwith MEL at 600 μg/L(A) and milk powder spiked at 4500 μg/kg(B)

Table 7 Recoveries of MEL in spiked milk and milk powder samples

a. Spiking concentration in milk samples;b. spiking concentration in milk powder samples.

3 结 论

选用双羧基的衣康酸(IA)为多齿功能单体, 采用沉淀聚合法合成了三聚氰胺(MEL)分子的印迹聚合物(MIP). 研究发现, 当MEL与IA摩尔比为1∶1.5时合成的MIP对三聚氰胺具有最佳选择性. 而此时IA的识别位点与三聚氰胺的可识别官能团摩尔比恰好为1∶1, 因此, 不会出现由过量功能单体引起的非特异性吸附. Scatchard分析结果表明, 在1～100 mg/L浓度范围内MIP对三聚氰胺只表现出特异性吸附. 以三聚氰酸为对照物时, MIP对MEL的选择性系数k=10.41. 以灭蝇胺为对照物时,kNIP<1而kMIP>1, 表明所合成的MIP对分子的形状有良好的识别能力. 上述结果表明, 相对于单齿功能单体, 基于多齿功能单体所合成的MIP在选择性上有显著优势. 将所制备的MIP用作固相萃取吸附剂, 建立了MISPE-HPLC/UV方法, 该方法具有良好的准确性和重现性, 可用于牛奶和奶粉中三聚氰胺的分析检测.