基于DNA纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗

张开翔, 刘军杰, 宋巧丽, 王丹钰,史进进, 张海悦, 李景虹

(1. 郑州大学药学院, 河南省肿瘤重大疾病靶向治疗与诊断重点实验室, 郑州450001;2. 清华大学化学系, 北京100084; 3. 长春工业大学化学与生命科学学院, 长春130012)

自噬是一种重要的细胞生物学过程, 是将受损的细胞器或蛋白质递送到溶酶体中进行降解, 在细胞的更新代谢中起重要作用[1,2]. 自噬过程对肿瘤细胞的影响根据所处环境的不同有显著区别, 基于自噬激活或自噬抑制的肿瘤治疗方法均有报道[3,4]. 对抗肿瘤化疗而言, 目前已有研究[5～7]指出, 通过抑制肿瘤细胞中的自噬过程可以有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性, 显著增强化疗药物对肿瘤的疗效. 因此, 本文设计了一种基于DNAzyme的自噬基因沉默体系, 用于辅助增敏抗肿瘤化疗.

基于DNAzyme对目标mRNA高效剪切的基因沉默方法是近年发展起来的一种新型基因沉默策略[8～10]. 经过特殊设计的DNAzyme对特定的靶标mRNA具有高特异的识别能力和高效的催化切割能力, 可以实现循环多轮的催化剪切反应, 有效沉默细胞中相关mRNA的功能[11]. 此外, DNAzyme比siRNA具有更高的生物稳定性且合成简单、成本较低, 目前已作为重要的基因沉默策略用于多种疾病的治疗[12,13]. 然而, 针对特定细胞的高效递送仍是DNAzyme应用领域面临的重要挑战[14,15]. 此外, 由于DNAzyme需要特定的辅助因子(如Ca2+, Mg2+等离子)来发挥剪切作用. 因此, 在设计递送体系时还需同时考虑辅助因子的共同递送.

DNA纳米花(NFs)是一种球形多孔的DNA纳米结构, 可以有效解决目前DNAzyme纳米递送中的成本高、生物稳定性低和工艺复杂等问题[16～21]. DNA纳米花可通过滚环扩增反应(Rolling circle amplification)合成, 由高浓度的DNA自组装包裹焦磷酸镁内核形成致密的纳米结构, 从而高效地形成含有大量功能性核酸序列的纳米载体[22～25]. 此外, 通过调整反应时间、改变模板序列设计等方法, 可以有效调整DNA纳米花的大小, 编码不同功能性的DNA单元[26]. 研究[21,27～29]表明, DNA纳米花具有显著的抗酶切性能, 在血清中可以稳定存在, 且纳米花中的DNA序列结构可以有效结合抗肿瘤药物阿霉素(Dox), 用于肿瘤细胞特异性的药物递送. 更重要的是, DNA纳米花合成过程中内核包裹的焦磷酸镁会在细胞的溶酶体酸性环境下崩解, 诱导溶酶体逃逸[16]; 而释放的Mg2+可以作为DNAzyme的辅助因子, 用于激活DNAzyme对目标mRNA的剪切能力[30,31].

本文通过滚环扩增反应制备了粒径约为200 nm呈花状球形结构的DNA纳米花. 该DNA纳米花编码了AS1411核酸适体序列,ATG5 DNAzyme序列和Dox结合序列(NFs/AS1411/ATG5/DOX), 且在溶酶体的微酸性环境下表现出响应性崩解的特征, 能够释放DNAzyme的辅助因子Mg2+, 实现高效的DNAzyme激活, 剪切肿瘤细胞内的自噬相关基因ATG5. 被剪切后的ATG5 mRNA不能被完整翻译而失去诱导细胞自噬的相关功能, 用于增敏Dox对人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞抑制效果, 实验原理如Scheme 1所示.

Scheme 1 Schematic diagram of DNA nanoflower for autophagy inhibition and enhanced antitumor chemotherapyDNA nanoflowers(NFs) were synthesized by rolling circle amplification(RCA), encoding 3 functional sequences: DNAzyme for ATG5 mRNA, AS1411 aptamer and Dox binding sites(NFs/AS1411/ATG5/DOX). NFs can be efficiently uptaken by cancer cells, degraded by the acidic condition in lysosome and release Mg2+ to trigger the cleavage activity of DNAzyme. The activated DNAzymes would cleave ATG5 mRNA inside cells and inhibit autophagy process, which lead to enhancing antitumor chemotherapy.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 序列见表1; 连接酶T4 DNA ligase, 聚合酶Phi29 DNA polymerase, dNTP混合溶液和磷酸激酶PNK购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司; 盐酸阿霉素(纯度>98%)购自大连美仑生物技术公司; 其它试剂均购自北京索莱宝科技有限公司.

Table 1 Sequence of oligonucleotides used in the experiment

荧光光谱分析采用RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司); MERLIN Compact型场发射扫描电子显微镜(德国Zeiss公司); 实时荧光PCR数据由T100TMThermal Cycler 型PCR仪(美国Bio-Rad公司)测定; 细胞成像照片用Zeiss LSM 800型激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)拍摄.

1.2 DNA纳米花的合成

1.2.1 DNA磷酸化反应 将环模板链(Circle, 终浓度10 μmol/L)、T4多聚核苷酸激酶(PNK酶, 终浓度2.5 U/μL)、ATP(终浓度1 mmol/L, pH=7.0)和灭菌双蒸水混合, 在T4多核苷酸激酶反应缓冲液(1×)中于37 ℃反应1 h.

1.2.2 成环连接反应 将环模板链(终浓度为1 μmol/L)和引物链(Primer, 终浓度1 μmol/L, 作为连接模板)混合, 在核酸连接酶缓冲液(1×)中于95 ℃加热5 min, 静置1 h逐渐冷却至室温. 将退火产物与T4 DNA连接酶(3.6 U/μL)在37 ℃下反应3 h, 生成环化DNA产物.

1.2.3 滚环扩增反应 将环化DNA产物(0.5 μmol/L)与Phi29 DNA聚合酶(2 U/μL)和dNTP混合液(1 mmol/L)在Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液(1×)中于37 ℃反应若干小时后, 再于90 ℃反应10 min, 酶失活使反应终止. 以12000 r/min速率离心20 min, 洗涤DNA纳米花3次, 于-20 ℃冰箱中保存备用. 使用前通过轻微涡旋或超声20 min分散DNA纳米花. 利用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)表征了合成的DNA纳米花的尺寸和形貌; 利用X射线能谱(EDS)和质谱(ICP-MS)分析了其元素组成和不同pH条件下的Mg2+释放量.

1.3 DNA纳米花剪切ATG5底物能力的表征

设计了2种以Mg2+作为辅助因子的核酶(DNAzyme)用于ATG5基因沉默, 首先通过体外核酸检测实验表征了2种DNA酶的剪切能力. 在200 μL反应体系中(DPBS缓冲液, 含10 mmol/L Mg2+), 将2种ATG5 DNAzyme(200 nmol/L)分别与底物ATG5(200 nmol/L)在37 ℃下共孵育5 h, 加入ATG5 F(200 nmol/L)和ATG5 Q(200 nmol/L)混合孵育30 min后, 移入96孔板中, 通过检测FAM荧光基团的荧光强度评估DNA酶对底物的剪切效率. 此外, 还利用变性PAGE胶分析了不同pH值条件下DNA纳米花对底物的剪切效率.

1.4 DNA纳米花负载化疗药物阿霉素(Dox)及pH响应释放的表征

将一系列浓度的DNA纳米花溶液超声分散后, 加入相同浓度的Dox并孵育一段时间, 测试其在595 nm处的荧光强度I. 将不存在DNA纳米花时Dox(100 μmol/L)的荧光强度定义为I0. 存在DNA纳米花时, Dox的荧光强度降低; 将荧光强度降低到平台值时对应的DNA纳米花浓度用于计算Dox负载能力, 该最小荧光值定义为If, 药物负载率计算式为[(I-If)/(I0-If)]×100%. 将DNA纳米花与Dox(100 μmol/L)加入PBS缓冲液(pH=7.4)中混合. 药物释放实验分为4组, 分别为 pH=7.4, pH=6.5, pH 7.4+DNAse I(5 U/mL)和 pH 5.0+DNAse I(5 U/mL). 此外, 还考察了负载阿霉素的DNA纳米花对ATG5底物的剪切能力.

1.5 细胞实验

利用Dox的荧光特性(激发波长为480 nm, 发射波长为 595 nm), 借助共聚焦显微镜和流式细胞仪分析了人乳腺癌细胞系MCF-7对DNA纳米花的摄取能力. 实验分为DOX组、NFs/AS1411/ATG5/DOX组和Random NFs/DOX组. 利用RT-PCR分析了DNA纳米花对MCF-7细胞中ATG5基因的沉默效果. 使用Custom gene qRT-PCR定量试剂盒(上海GenePharma公司)进行测试. 首先, 利用Trizol试剂提取各组细胞中的总RNA, 提取后每组均使用Nanodrop对RNA总浓度进行定量, 并用DEPC水稀释为相同浓度(200 ng/μL); 之后利用逆转录试剂对RNA进行逆转录, 得到cDNA后利用PCR方法进行扩增. 30 μL的反应体系中包含15 μL 2X PCR supermix, 1.5 μL primers, 0.6 μL 50X ROX reference dye, 3 μL 逆转录得到的cDNA和10 μL水. 每组反应均重复3次. RT-PCR反应条件: 95 ℃/3 min, 再重复35次95 ℃/30 s, 58 ℃/30 s, 72 ℃/30 s的循环. 每组样品中mRNA的表达水平以GAPDH为标准归一化. 此外, 还利用CCK-8试剂分析了DOX, NFs/AS1411/ATG5/DOX, Random NFs/DOX, NFs/AS1411/ATG5及Random NFs溶液(DOX: 32 mmol/L, NFs: 160 nmol/L)对MCF-7细胞的毒性, 并利用Annexin V-FITC和Propidium Iodide染色结合流式细胞仪分析了细胞凋亡情况.

Fig.1 Characterization of synthesized DNA nanoflowers (A) Agarose gel electrophoresis of synthesized DNA nanoflower. Lane 1: DNA ladder, lane 2: ligated DNA circle, lane 3: synthesized NFs; (B) DLS analysis of size distribution of NFs; (C) Zeta potential of NFs; (D) SEM image of NFs; (E) TEM imaging of NFs; (F) EDS element analysis; (G) ICP-MS analysis of the released Mg2+ concentration of NFs at pH 7.4, 6.0 and 4.5.

2 结果与讨论

2.1 DNA纳米花的表征

DNA纳米花(NFs)的表征结果如图1所示. 由凝胶电泳实验结果[图1(A)]可见, 合成的NFs(Lane 3)因分子量较大, 在凝胶上无明显移动, 基本处于加样处. 而环化连接后的DNA(Lane 2)则会在琼脂糖胶上较快移动, 初步证实经RCA 反应合成了尺寸较大的DNA产物. 利用动态光散射(DLS)方法分析了合成的DNA纳米花的平均粒径和Zeta电位, 由图1(B)和(C)可见, NFs的平均水合粒径约为200 nm, 平均电位约为-35.4 mV, 与DNA本身携带负电荷的性质一致. SEM照片[图1(D)]和TEM照片[图1(E)]显示, NFs表面呈花瓣状, 粒径约200 nm, 分布均匀, 证明DNA纳米花已成功制备. 为更好地分析DNA纳米花的元素组成和结构, 利用EDS能谱对其进行了元素分析[图1(F)], 发现纳米花中存在N, O, Mg和P等元素, 这与文献[30]报道的DNA纳米花包含焦磷酸镁的表征结果一致. 实验中分析了NFs在不同pH条件下Mg2+的释放情况[图1(G)]. 当pH=7.4时, Mg2+的释放量约30.8 μg/mL; 当pH=6.0 和4.5时, Mg2+释放量分别约为204.7和317.8 μg/mL. 此结果表明, 随着酸性增强, NFs对Mg2+的释放量显著增加, 且在溶酶体的酸性条件下能大量释放Mg2+, 可作为DNAzyme的辅助因子用于增强DNAzyme在细胞中的基因沉默效果.

2.2 DNA纳米花的ATG5 mRNA剪切能力

为分析DNA纳米花中编码的DNA酶对ATG5 mRNA的剪切能力, 首先采用荧光和凝胶电泳的体外表征方法分析了NFs对底物的剪切能力. 由图2(A)可见, 编码了DNAzyme的纳米花对底物的剪切能力比相同浓度的DNAzyme明显提高, 这主要是由于DNA纳米花携带了诸多DNAzyme的重复序列, 因此, 在较低的浓度(10 nmol/L)下仍能高效率地剪切底物. 此外, 由之前的讨论可知, DNAzyme的剪切催化活性高度依赖Mg2+, 然而细胞中游离Mg2+离子的浓度较低, 难以促进DNAzyme催化结构域的形成. 如图2(B)所示, 在酸性条件下, 当反应体系中不存在Mg2+时, 单纯的DNAzyme基本无剪切能力, 而NFs则因自身可以释放Mg2+, 故对底物仍有较高的剪切效率. 本文使用的DNA纳米花浓度与游离的DNAzyme浓度相同. 除荧光方法外, 本文还利用变性PAGE凝胶电泳分析了不同条件下NFs对底物的剪切情况. 由图2(C)可见, 不同pH条件下NFs在凝胶电泳中无明显移动. 而随着反应时间的增加, NFs对底物的剪切逐渐增多, 剪切产物条带的强度逐渐增强. 由于DNA纳米花的结构通常被认为是DNA链包裹焦磷酸镁, 而焦磷酸镁会在酸性环境下释放Mg2+, 酸性越强Mg2+释放越多[30]. 因此, 还考察了不同Mg2+浓度对应的DNAzyme的剪切效率. 由图2(D)可见, 当反应体系中不存在Mg2+时, DNAzyme对底物几乎无剪切活性; 当Mg2+浓度为10 mmol/L时, 反应体系中的DNAzyme比5 mmol/L Mg2+存在时具有更高的剪切效率.

Fig.2 DNAzyme cleavage activity of NFs(A) Fluorescent analysis of NFs and DNAzyme with different molar ratios; (B) cleavage analysis without Mg2+; (C) PAGE analysis of cleavage activity with different pH values and NFs/substrate molar ratios. Left lane: ATG5 substrate. The substrate concentration was constantly 400 nmol/L. Time ranges in (C) were 10, 120 and 300 min, respectively; (D) cleavage activity of DNAzyme with different concentrations of Mg2+.

2.3 DNA纳米花的阿霉素(Dox)负载和释放性能

阿霉素分子能高效插入DNA纳米花中的核酸序列, 可被NFs高效负载[32,33]. 由图3(A)可见, 固定Dox浓度为100 μmol/L时, 随着NFs浓度逐渐增大, 其对Dox的负载率也逐渐提高. 当NFs浓度为250 nmol/L时, 计算所得负载率约为97.4%. 由药物释放实验结果[图3(B)]可见, 包载了Dox的NFs在正常生理条件下比较稳定, 阿霉素 48 h的释放量仅为19.7%; 而在pH=5.0的环境下, 阿霉素48 h的释放量为90.1%, 与DNase处理的对照组药物的释放效率相当, 证明其具有pH敏感的药物释放特性, 有望减少NFs对正常组织的毒副作用. 此外, 还分析了负载Dox后的NFs对ATG5 mRNA的剪切效率, 结果[图3(C)]表明, 负载了Dox的NFs仍然可以高效剪切ATG5 mRNA, 剪切效率与未负载Dox组无明显差异.

Fig.3 Dox loading and release capacity of NFs(A) 100 μmol/L Dox was incubated with different concentrations of NFs; (B) pH and DNase triggered release of Dox from NFs; (C) DNAzyme cleavage activity of NFs before and after Dox loading.

2.4 DNA纳米花的细胞摄取过程

DNA纳米花中编码的AS1411核酸适配体可以介导高效的细胞内吞[34,35]. 为进一步研究NFs识别靶细胞的特异性和Dox递送能力, 采用荧光共聚焦显微镜观察了MCF-7细胞对DNA纳米花的摄取过程[图4(A)]. 由荧光成像结果可见, NFs/AS1411/ATG5/Dox在MCF-7细胞内的荧光强度与游离Dox组相当, 主要集中在细胞核部位; 而作为对照组, Random NFs/DOX的荧光强度很低. 这主要是因为NFs内编码的AS1411适配体可以特异性结合肿瘤细胞表面高表达的核仁素蛋白, 而对非恶性肿瘤细胞几乎无影响. 此外, 使用流式细胞仪表征了MCF-7细胞对DNA纳米花的摄取情况[图4(B)], 实验结果表明, MCF-7对游离Dox的摄取速度最快, 4 h的摄取率为99.73%, NFs/AS1411/ATG5/DOX在8 h时的摄取率为99.55%, 而Random NFs/Dox的摄取率仅为30.94%.

Fig.4 Tumor cell targeting ability of NFs(A) Confocal imaging of MCF-7 cells incubated with Dox, NFs/AS1411/ATG5/Dox and Random NFs/Dox; (B) flow cytometry analysis of MCF-7 cells incubated with Dox, NFs/AS1411/ATG5/Dox and Random NFs/Dox.

2.5 DNA纳米花的细胞自噬抑制和增敏抗肿瘤化疗性能

为研究NFs递送至MCF-7细胞后能否抑制自噬相关基因ATG5的表达, 利用RT-PCR方法检测了不同NFs处理后的细胞中ATG5的表达量. 由图5(A)可见, 与空白对照组相比, NFs/AS1411/ATG5处理后的MCF-7细胞中ATG5的表达量显著降低, 而Random NFs阴性对照组细胞中的ATG5含量无显著变化, 表明编码DNAzyme的NFs在MCF-7细胞内能有效剪切ATG5 mRNA. 此外, 通过CCK-8实验分析了不同NFs组对MCF-7细胞的抑制作用[图5(B)], 结果表明, NFs/AS1411/ATG5/Dox组对MCF-7细胞的抑制率显著高于其它组, 与游离阿霉素相当. 因为DNA纳米花本身结合Dox的特性会影响阿霉素对肿瘤细胞的抑制能力, 以上结果证实了基于DNA纳米花的自噬抑制策略有望增强抗肿瘤化疗药物的疗效.

实验中还利用Annexin V-FITC和Propidium Iodide染色结合流式细胞仪方法分析了各类NFs诱导MCF-7细胞的凋亡情况. 实验结果[图5(C)]表明, NFs/AS1411/ATG5/Dox组诱导的细胞凋亡率最高, 显著高于Random NFs/DOX组, 表明所设计的多功能DNA纳米花结构凭借其高特异的肿瘤细胞识别能力及高效的细胞自噬相关基因沉默能力, 可以显著增敏抗肿瘤化疗效果, 为生物医学应用和癌症治疗研究提供了实验基础.

3 结 论

设计了一种新型的多功能DNA纳米花结构, 可以实现基于核酸适体的肿瘤细胞靶向和自噬相关ATG5基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗. 设计合成的DNA纳米结构具有如下特点: DNA纳米花编码的核酸适配体AS1411可以特异性靶向肿瘤细胞表面高表达的核仁素蛋白, 用于高效的靶向药物递送; DNA纳米花在细胞溶酶体的酸性环境中可快速释放Mg2+, 用于激活DNAzyme的剪切活性; 激活后的DNAzyme序列可以剪切自噬相关基因ATG5 实现自噬基因沉默, 且可以和化疗药物Dox协同作用增敏化疗, 促进肿瘤细胞凋亡; 通过将Dox嵌入核酸序列的形式显著提高了纳米花的药物负载量. 此外, 该DNA纳米结构具有合成简单、生物相容性好, 能够通过改变序列设计实现多重功能等优势, 在生物医药领域具有巨大的应用潜力.