程序性坏死与急性肺损伤*

王文妍， 刘亚楠， 黄威， 陈仲清

南方医科大学南方医院重症医学科、广东省休克微循环重点实验室(广东广州 510515)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种常见的临床疾病，常见于脓毒症、外伤、移植后反应等，病理学表现为弥漫性肺泡损伤。严重的ALI可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，美国的一项统计显示，每年超过190 000例ALI患者发展为ARDS，并导致75 000例死亡[1]。目前认为ALI可能通过炎症级联反应、氧化应激反应或细胞死亡引起，但其发病机制至今仍未完全明确。细胞死亡的方式分为凋亡和坏死，以往的研究认为凋亡是唯一可控的死亡模式，坏死则是不可控的[2]。但是最近的研究从基因、生物化学及功能学上表明，坏死也可以被一定的细胞信号通路调控。与凋亡时细胞的胞质及染色质固缩、核破裂、释放凋亡小体等不同，坏死细胞的病理形态主要表现为细胞膜及溶酶体膜通透性增高、细胞器肿胀、染色质轻度缩合、核保持不变等。程序性坏死在疾病的病理生理过程中的作用已经逐渐被发现，在心血管、肾脏、肝脏、神经系统的感染、缺血再灌注、肿瘤、全身炎症反应综合征及药物相关性器官损伤的发生发展中均发现程序性坏死的参与。研究表明程序性坏死在肺损伤中也扮演着重要角色。本文就程序性坏死的具体分子机制及疾病病理生理相关作用进行综述，并总结了近几年程序性坏死相关ALI的研究，为ALI的诊疗及预后判断提供了新的思路和手段。

1 程序性坏死的分子机制

目前最常讨论的程序性坏死是由受体相互作用蛋白3(protein kinase 3，RIP3)及受体混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)相互作用介导的，被称为坏死性凋亡(necroptosis)的死亡方式[3]。其中最经典的通路即通过肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor，TNF-α)诱导的程序性坏死。TNF-α与其受体TNFR1(TNF receptor 1)相互作用，激活受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)使其发生磷酸化，活化的RIP1和RIP3通过RIP同型结构域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)相互作用[4-5]，使RIP3聚集及磷酸化，与RIP1形成坏死小体(necrosome)，向下激活MLKL，使MLKL形成聚合体，并使胞膜上钙离子及钾离子通道开放或直接通过四螺旋束结构域(4-helical bundle domain)的氨基末端结合在胞膜上成孔导致细胞死亡[6-7]。RIP1/RIP3/MLKL聚合体形成使MLKL寡聚后由胞质向胞膜转移是程序性坏死执行细胞死亡过程至关重要的步骤(图1)。

除了TNF-α可激活经典的程序性坏死之外，TNF超家族也可通过与胞膜上的死亡受体结合，形成死亡诱导复合物(death-inducing-signalling complex，DISC)，并且在抑制IAP及Caspase-8活化的条件下引起程序性坏死[8]。LPS及dsRNA可通过Toll样受体TLR4及TLR3[9]、外源性DNA进入胞质可通过刺激ZEBP1蛋白诱导干扰素(interferon，IFN)生成促进程序性坏死[10]。这些通路最终均可在Caspase-8失活的条件下，诱导RIP1/RIP3/MLKL坏死小体的产生。

图1 RIP1/RIP3/MLKL相互作用示意图

2 TNF-α 激活程序性坏死通路的调控

TNF-α刺激细胞激活MLKL蛋白启动程序性坏死受到多种蛋白的调控。TNF-α是一种多效性细胞因子，在感染或组织损伤引起的炎症中起关键作用，但是在某些情况下，也可有效诱导细胞死亡。TNF-α信号主要通过TNFR1诱导下游基因表达，TNFR1激动引起的RIP1依赖性程序性坏死的启动需满足2个条件：Caspase-8被灭活或RIP1去泛素化。

2.1 TNF-α结合TNFR1诱导复合体Ⅰ形成 首先，TNFR1识别TNF-α后，在胞质中通过TNFR1相关的死亡域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD)、RIP1和E3连接酶[TNF受体相关因子2 (TNF receptorassociated factor 2，TRAF2)、细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)及线性泛素链组装复合体(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)]结合形成的复合体Ⅰ。其中，TRAF2、IAP、LUBAC构成的复合体是复合体Ⅰ内的线性泛素化链，可激活核因子-κB(NF-κB)从胞质复合体中解离入核并调节基因表达，有利于促炎反应及阻止细胞凋亡。使用胱天蛋白酶(second mitochondrial activator of caspase，SMAC)模拟物，可通过抑制IAP蛋白家族的几种E3连接酶，如cIAP1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein)或XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)，使RIP1去泛素化，诱导程序性坏死；去泛素酶CYLD(cylindromatosis)也可通过使Lys63连接的泛素化从RIP1上解离介导坏死作用[11]。

2.2 复合体Ⅰ失稳形成复合体Ⅱa引起凋亡 复合体Ⅰ不稳定时会产生复合体Ⅱa，由TRADD、Fas相关的死亡域蛋白(Fas-associated death domain-containing protein,FADD)及Caspase-8组成，可直接诱导凋亡[12]，Caspase-8灭活则使凋亡转为坏死。在胞质中同时存在两种不同形式的 FADD 样白细胞介素-1β转化酶抑制蛋白FLIP[FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme (FLICE)-inhibitory protein，FLIP]，其中cFLIP的长形式cFLIPL具有无活性的Caspase 样结构域，可与Caspase-8的Caspase结构域形成异源二聚体，促进Caspase-8激活[13]，激活的Caspase-8具有剪切RIP1、RIP3及去泛素化酶CYLD的作用，可抑制程序性坏死[14-15]。相反，短形式的cFLIPS可以抑制Caspase-8激活。因此，在cFLIPL存在时，Caspase-8活化导致RIP1及RIP 被剪切，最终导致凋亡。

2.3 去泛素化或灭活Caspase-8促进复合体Ⅱb形成并向下激活程序性坏死 在IAP抑制剂(SMAC模拟物)或Caspase-8灭活剂[16-17]存在时，会形成另外一种复合体Ⅱb，包括 RIP1、RIP3和FADD及Caspase-8，在RIP3和MLKL的水平足够高时，RIP1及RIP3形成坏死小体，从而引起坏死。研究发现，RIP1通过Ser14/15、Ser20、Ser161和Ser166位点[18]、RIP3通过Ser-227(h)Thr-231 和 Ser-232(m)位点[19]、MLKL通过T357和S358位点[20]发生磷酸化继而进一步激活程序性坏死过程。而RIP1、RIP3及MLKL分别可以被necrostatins[18，21]、GSK 872及NSA(necrosulfonamide)[22]特异性抑制(图2)。

图2 调控TNF-α介导程序性坏死的分子机制[2]

通常认为RIP1会引起RIP3磷酸化促进下游发生程序性坏死，但是也有研究表明，RIP1可通过非激酶活性依赖的结构性的功能促进细胞存活而抑制凋亡和坏死[23]。在FADD缺乏的细胞中，RIP1激酶失活的细胞可以抑制但不能完全阻断RIP3诱导的坏死，说明依赖和不依赖RIP1酶活性的坏死通路都是存在的。

综上所述，多种细胞因子或细胞损伤分子模式均可在一定条件下引起程序性坏死，在这一过程中，RIP1及RIP3形成坏死小体是关键步骤，最终引起细胞膜离子通道开放，细胞肿胀破裂，释放大量细胞因子，造成炎症反应及组织损伤，严重的可引起全身炎症反应综合征，导致全身多器官损伤。

3 程序性坏死与ALI

目前，导致ALI的原因主要有感染、高氧刺激、机械通气引起的物理损伤等，同时也可能由全身状况引起，特别是脓毒症、休克、免疫反应相关的器官损伤等。严重的ALI可能发展为ARDS，以发展快、弥漫性、严重的低氧血症及最终的肺水肿、呼吸衰竭为特征。这些因素和症状涉及广泛的肺部细胞损伤，并且在多项研究中也已证实程序性坏死在这一过程中扮演重要角色。

3.1 肺部感染 肺部感染是常见的感染性疾病，包括细菌性、病毒性及不典型病原菌感染。肺部感染是导致ALI发生最常见的原因[2]。常见的细菌感染如肺炎双球菌、沙雷菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌及耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌均可通过程序性坏死导致细胞死亡[24-30]。大多数病原体可以释放细胞毒性产物杀死细胞，其中最常见的是成孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，高浓度的PFT可以形成溶解孔，低浓度则可以升高细胞膜通透性导致离子失调，如钙离子内流及钾离子外流，而激活程序性坏死[24]。沙雷菌、肺炎球菌及金黄色葡萄球菌等感染的小鼠支气管上皮可观察到显著的p-MLKL水平升高，并且体外实验已经证实RIP1/RIP3/MLKL抑制剂预处理可预防其引起的细胞死亡[24]。说明在革兰阳性菌及阴性菌感染中均可发生程序性坏死，并且抑制程序性坏死可在细菌感染中保护细胞，减轻损伤。

结核杆菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染可以抑制凋亡并促进坏死来杀死感染的巨噬细胞。结核坏死毒素(tuberculosis necrotizing toxin，TNT)分泌到细胞质中水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)。NAD+水解所致的线粒体去极化和ATP生成抑制导致糖酵解的增多及细胞外酸化，激活RIP3和MLKL，导致坏死。抑制RIP3或MLKL均可保护巨噬细胞，这一过程不依赖于TNF-α及RIP1[25]。也有文献提出，在结核杆菌感染的鼠纤维母细胞中，在TNF-α的协同作用下发生RIP1依赖的MLKL磷酸化为特征的程序性坏死。鼠巨噬细胞中则发生依赖RIP1但不依赖MLKL磷酸化的坏死性细胞死亡。总之，不论TNF-α存在与否，结核杆菌感染的细胞都会发生RIP3依赖的坏死，说明RIP3在结核菌引起的程序性坏死中的核心作用。程序性坏死可以使细菌从巨噬细胞中逃逸或直接进入细胞外环境，对促进肉芽肿性炎症的发生、发展至关重要[26]。而另一方面，通过程序性坏死引起细胞的迅速死亡，反而能够减弱TNF-α或LPS引起的炎症反应，敲除RIP3或MLKL可以恢复TNF-α诱导的细胞因子产生。与坏死过程中释放损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)相比，TNF-α或LPS直接诱导细胞因子具有更强的促炎作用。病原体感染导致的程序性坏死诱导细胞快速死亡，阻断了损伤细胞持续释放炎症因子，这一机制也有利于细胞内病原体通过程序性坏死抑制宿主免疫反应[27]。目前关于程序性坏死在结核菌感染中的研究显示，程序性坏死对巨噬细胞的损伤导致病原体逃逸，并减弱了炎症反应，不利于感染控制。

除了细菌外，病毒感染也可以诱导程序性坏死。例如甲型流感病毒感染巨噬细胞和上皮细胞后，其NS1蛋白可以通过与MLKL相互作用增加MLKL低聚和膜易位，从而增加程序性坏死[28]。新型甲型流感病毒N7N9严重感染也与cIAP下调及肺上皮的坏死相关。cIAP2可以保护肺组织不受流感病毒感染的伤害并促进宿主存活，敲除cIAP2可促进坏死小体的形成，使小鼠死亡率升高[29]。但是一些研究显示，在甲型流感病毒感染的小鼠模型中，阻断RIP3活性会增加病毒滴度，鼠巨细胞病毒及单纯疱疹病毒也可以阻止程序性坏死，从而使病毒扩散[24]，说明细胞发生程序性坏死减少了病毒大量复制，对机体有益。某些病毒也可以通过引起TNF-α刺激细胞的快速坏死，阻断炎症因子持续释放从而故意阻断宿主的炎症反应，杀死前驱感染细胞还能够促进病毒的释放。因此也可以将坏死视为对病原体扩散有利的反应[27]。

通常认为细胞坏死主要以溶酶体膜通透性增加，细胞肿胀破碎并释放大量细胞因子为主要特征，可引起炎症反应，造成肺部屏障损伤，促进病原体侵入。严重的炎症级联反应可进一步导致细胞死亡，释放大量DAMPS，加重器官损伤。但是根据感染病原体致病机制的不同，最终引起的病情转归可能截然相反。坏死导致的细胞快速死亡也可能阻断TNF-α的持续释放，反而可以减轻后续可能引起的炎症风暴，也可以抑制病毒大量复制扩散。这提示我们在临床分析病情及指定治疗方案时，需要考虑到更多的情况。虽然程序性坏死在病原体造成的损伤中的具体机制及作用还未完全明确，但是目前的共识表明，程序性坏死在病毒性肺炎期间主要具有保护作用，是感染的肺细胞中止病毒复制的一种方法，而在细菌性肺炎期间则是有害的，但是目前并无直接通过改善程序性坏死进行干预的治疗手段。

3.2 脓毒症相关ALI 脓毒症3.0定义中，脓毒症是宿主对感染的反应失调引起危害生命的器官功能损害，即由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。在脓毒症中，坏死细胞释放多种DAMPS刺激持续的炎症因子释放，加剧了器官损伤。脓毒症时约有40%进展为ALI或ARDS，是引起ARDS最常见的原因[31]。敲除Caspase-3、Caspase-7或Caspase-1不能改善严重SIRS，但是敲除RIP3可以完全避免SIRS造成的细胞死亡，并且减少循环 DAMPS 的水平。使用Nec-1抑制RIP1活化也具有相同的效果[30]，提示在脓毒症中，对机体产生损伤的主要机制可能是坏死而非凋亡。更进一步的研究发现，抑制RIP1激酶活性可减少内皮细胞程序性坏死，防止脉管断裂、凝血级联反应及器官损伤，间接抑制促炎因子的产生，从而改善TNF/zVAD诱导的休克[32]。敲除RIP3减弱了CLP诱导的ALI，从而改善肺部结构的完整性，减少肺中性粒细胞浸润[33]；同时也可减弱小鼠肺损伤，并降低肺泡灌洗液中炎症因子的水平，从而提高LPS诱导的ARDS小鼠生存率[34]。抑制RIP1激酶活性同时减少RIP3可以在TNF-α诱导的SIRS中起保护作用[2]，除此之外，necrostatin也可能对TNF-α诱导的细胞因子有直接抑制作用，有研究发现在necrostatin存在的情况下，TNF-α诱导产生的IL-6减低，而IL-6在SIRS中起到重要作用[30]。在临床上，有研究表明ICU的患者血浆中RIPK3水平升高与院内病死率和器官衰竭相关[35]。

以上数据显示程序性坏死可能是一种潜在的脓毒症治疗靶点。动物实验中抑制坏死通路的关键蛋白RIP1及RIP3活化可对脓毒症有显著的改善作用，临床检测中也发现RIPK3水平与脓毒症病死率的相关性。这可能为SIRS 和脓毒症的诊断及治疗提供有价值的分子标志物。

3.3 机械通气及高氧损伤 机械通气是危重患者生命支持的重要手段，常应用于改善ALI患者出现的低氧血症，但是使用不当也可引起肺组织过度扩张及局部不张，诱发和加重炎症反应。机械通气造成的压力性机械损伤及高氧环境均可引起气道及肺泡上皮细胞的程序性坏死，加重肺部损伤。高潮气量可导致大鼠肺泡结构紊乱及炎症细胞浸润，肺组织内 RIP1/RIP3/MLKL水平较自主呼吸相比均升高，Nec-1则可以减轻高潮气量造成的肺损伤[36]。高氧环境也会对细胞产生损伤，氧分压>50 kPa就会造成高氧急性肺损伤。以往认为高氧是通过直接升高胞内活性氧簇(ROS)，引起后续的炎症反应和应激反应造成的，但是研究中发现RIP1/RIP3/MLKL的表达同时上调，说明高氧刺激激活了程序性坏死。使用依达拉奉和Nec-1治疗可逆转丙二醛(malondialdehyde，MDA)上升，使得谷胱甘肽及超氧化物歧化酶降低[37]，从而减轻高氧导致的肺损伤。MDA可作为氧化应激和自由基介导损伤的标志物。故在对已经存在肺损伤或ARDS的患者使用机械通气时，应考虑到气压伤及高氧损伤的可能，需监控气道压及氧合指数，及时调整氧流量及给氧浓度，预防可能造成的医源性损伤。

3.4 移植后肺损伤 原发性移植物功能障碍(primary graft dysfunction，PGD)是肺移植后发病和死亡的主要原因，缺血再灌注(ischemia/eperfusion，IR)是其关键原因，necrostatin-1治疗可显著抑制 IR 诱导的坏死细胞死亡和线粒体ROS的产生[38-39]。研究发现，在缺血再灌注过程中可以观察到炎症细胞浸润和程序性坏死的增加，而非凋亡。随低温保存和再灌注后时间的增加，磷酸化的RIP1逐渐增多，临床肺移植中也证明，肺上皮细胞坏死的程度与PGD的发生有关。并且，在其他器官移植造成的肺损伤，例如肾移植后肺损伤中，也发现了程序性坏死。近年来，越来越多的实验室和临床证据提示急性缺血性肾损伤可诱发远端肺损伤，推测是因为促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-1b、IL-6的释放，特别是TNF-α从损伤的肾组织进入体循环和肺循环，引起肺组织损伤和炎症，其中程序性坏死起关键作用，并且损伤严重程度与TNF-α水平有关[40]。

移植后损伤是复杂的过程，单纯抑制细胞死亡改善并不足以逆转其损伤，还需同时考虑缺血再灌注及免疫反应造成的损伤。这些研究为改善移植手术流程及移植患者远期预后提供分子基础，也为开发治疗此类围手术期并发症的新策略提供了依据。

4 展望

综上所述，越来越多的证据证明了程序性坏死在人类肺疾病病理生理过程中的重要性。它可以直接导致细胞死亡，进而引起炎症级联反应。敲除关键蛋白可提高动物的生存率，减轻肺部病理改变及细胞损伤，降低炎症因子水平。但是也有研究表明程序性坏死使细胞直接死亡，从而避免了促炎因子的过度释放，最终抑制炎症反应。根据目前研究，程序性坏死对宿主有益还是对病原体有益取决于具体情况，其在不同疾病中的关键机制仍未完全明确，且程序性坏死与其他死亡模式的相互关系也需要深入阐明。在今后的研究中，可对疾病进行进一步分类，按照不同类别探究程序性坏死在疾病发展过程中存在积极或消极作用，及其具体的分子机制。并且，仍需深入研究发现具有特异性的程序性坏死生物标志物及具有针对性的干预措施，以将程序性坏死相关性研究应用于临床疾病的诊断及治疗中。