特发性扩张型心肌病患者冠状动脉粥样硬化的早期病理特征*

郝俊海， 吴敏， 骆新兰， 陈婉雯， 梁远锋， 林展翼

1南方医科大学第二临床医学院 (广东广州 510280)； 广东省人民医院(广东省医学科学院) 2心血管外科， 3病理医学部， 4心血管内科, 5老年医学科(广东广州 510080)

特发性扩张型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy, IDCM)是一种原因未明、以心室扩大及收缩功能减退且进行性加重的原发性心肌病。根据WHO诊断标准，诊断IDCM需先行冠状动脉(下简称“冠脉”)血管造影检查排除严重冠脉狭窄(管腔狭窄程度≥50%)[1-2]。研究显示明确诊断IDCM患者中存在血管造影与病理检查不一致的情况[3-5]。Repetto等[6]对55例行心脏移植术的IDCM患者冠脉树进行病理检测，结果显示1/4的患者存在严重冠脉粥样硬化，可能进一步加重心功能障碍。而冠脉粥样硬化是一种常见的具有增龄性改变的慢性炎症疾病，儿童时期即可以出现血管相应的病理改变，并随着年龄的增长而加重。由于冠脉标本获取困难，冠脉粥样硬化的病理研究特别是初期轻微病变的研究较为缓慢。美国心脏协会于1992年将由平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)、弹性蛋白和蛋白多糖形成的、无脂质或巨噬细胞浸润的肌弹性内膜增厚(musculoelastic intimal thickening)定义为弥漫性内膜增厚(diffuse intimal thickening, DIT)[7]。而SMCs是参与DIT发生、进展的主要细胞，通常表达Ki-67[8]、Bax[9]、TEM1[10]等一系列抗原表征细胞增殖、凋亡、表型转换等特征。然而，IDCM患者合并冠脉DIT病变病理特征及SMCs的性质和行为尚未完全揭示。本研究拟对IDCM患者冠脉DIT病变特点及SMCs在其中的作用进行研究，以丰富对IDCM合并冠脉轻微病变的认识。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择自2017年11月1日至2018年8月30日在我院行心脏移植术治疗终末期IDCM的患者共18例，术前经过患者(未成年患者经监护人)及家属同意并签署书面知情同意书后，在患者心脏移植术取下病心后提取冠脉。收集患者年龄、性别、病史资料、术前心脏彩超等资料。患者的基本情况及临床资料见表1。研究方案经医院伦理委员会批准。

1.2 组织学染色及免疫组织化学染色 仔细解剖病心，提取冠脉树，多聚甲醛固定后常规石蜡包埋，并进行连续病理切片。按照流程分别对组织切片进行苏木精-伊红(HE)、Masson三色(Masson-trichrome)及VERHOEFF′S VAN-GIESON(EVG)染色。制片完成后使用倒置相差显微镜进行进一步分析。

为进一步明确细胞性质，对固定的冠脉标本再次进行石蜡切片，根据说明书使用抗CD163抗体、抗caldesmon抗体、抗smoothelin抗体、抗Ki-67抗体、抗Bax抗体、抗TEM1抗体进行免疫组化染色，添加生物素标记二抗，继而使用DAB显色，并用苏木精复染。

表118例患者的基本信息和临床资料

项目数据年龄(岁) 42.2±12.2年龄范围(岁)12～55性别[例(%)] 男10(56.0) 女8(44.0)吸烟史[例(%)]2(11.1)嗜酒史[例(%)]0(0.0)心肌病家族史[例(%)]1(5.6)高脂血症[例(%)]2(11.1)糖尿病[例(%)]0(0.0)高血压[例(%)]0(0.0)其他血管疾病[例(%)]1(5.6)左房大小(mm)∗53.8±10.8右房大小(mm)∗58.6±11.5右室直径(mm)∗70.2±14.1左室收缩末期直径(mm)∗68.3±10.1左室舒张末期直径(mm)∗77.4±11.6左室射血分数(%)∗26.6±7.3

注：*为移植前最近一次心脏彩超数据

1.3 病变程度评估 采用内膜厚度(intimal thickness)、内膜-中膜厚度比(intima-media ratio, I/M)来定量评估DIT病变程度。选取HE染色，使用CCD照相系统分别在高倍镜下(20×)拍摄切片，每张切片约拍摄4～6个部位，拍照后测定内膜厚度、中膜厚度，并计算I/M。

2 结果

2.1 DIT的病理特征 18例患者的冠脉均存在不同程度的粥样硬化病变，其中6例患者在冠脉树病理切边组织中尚可发现DIT病变，而其余11例患者切片组织中最轻的病变已经为病理性内膜增厚病变，1例患者的组织学改变已完全是粥样硬化斑块。对6例患者的病理染色进行进一步分析，组织学染色显示DIT病变内皮细胞层大体完整，内膜呈局部增厚或局部严重的弥漫性增厚，即同一切片存在不同程度的DIT病变。EVG染色结果显示，部分病变部位内弹力层(internal elastic lamina, IEL)形态规则、结构完整，而另一部分病变部位IEL呈不同程度碎片化。根据IEL形态将DIT病变分为IEL完整组、IEL碎片化组，高倍镜下HE染色显示IEL完整组内皮完整，内膜较薄，中膜结构完整，而IEL碎片化组内皮细胞层粗糙，内膜增厚、细胞数增多，内中膜界限欠清晰，中膜内层平滑肌细胞形态异常。而Masson染色显示IEL碎片化组内膜增厚，内膜胶原含量(蓝色显示)增多。分别测定IEL完整组和IEL碎片组内膜厚度为(70.1±6.5)μmvs(154.0±3.8)μm，差异有统计学意义(P<0.001)，内膜-中膜厚度比为0.49±0.04vs0.98±0.09，差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。

注：A：DIT病变HE染色，DIT病变内皮细胞层大体完整，内膜呈局部增厚或局部严重的弥漫性增厚，即同一切片存在不同程度的DIT病变；B：DIT病变EVG染色；C：IEL完整组EVG染色，内弹力层(internal elastic lamina, IEL)形态规则、结构完整；D：IEL碎片化组EVG染色，IEL呈不同程度碎片化；E：IEL完整组HE染色，F：IEL碎片化组HE染色，相比IEL完整组，IEL碎片化组内皮细胞层粗糙，内膜增厚、细胞数增多，内中膜界限欠清晰，中膜内层平滑肌细胞形态异常；I：IEL完整组与碎片化组内膜厚度比较 *P<0.001；J：IEL完整组与碎片化组内膜-中膜厚度比比较 *P<0.001

图1弥漫性内膜增厚(DIT)的病理特征

2.2 SMCs的增殖、凋亡与表型转化 为明确细胞类型和细胞学行为，对6例患者的冠脉切片行免疫组化染色检查。IEL正常组内皮下层可见Caldesmon阳性、smoothelin阴性细胞，内膜可见Bax阴性细胞，同时，Ki-67、TEM1在内膜、中膜均未见阳性表达IEL碎片化组内膜明显增厚，其内可见大量Caldesmon阳性细胞，部分细胞同时呈smoothelin阳性。碎片化组内膜可见TEM1阳性细胞，同时内膜、中膜内层Bax阴性细胞明显增加。而Ki-67在内膜、中膜均未见阳性表达(图2)。

3 讨论

IEL是由弹性纤维形成的多孔致密柔性屏障，在冠脉中作为内膜与中膜的分界线，其孔隙结构可调节内中膜间大分子物质和细胞的交换[11]。IEL孔隙结构增大可允许低密度脂蛋白等致粥样硬化大分子物质通过，影响粥样硬化病变发生及发展[12-14]。根据EVG染色结果对DIT病变进行分类，IEL完整组内膜厚度、I/M、内膜细胞数量和细胞外胶原含量均较低，提示病变程度较轻。而IEL碎片化组内膜厚度、I/M、内膜细胞数量和细胞外胶原含量明显提高，提示病变程度较严重。IEL完整性是影响内、中膜物质和细胞交换的重要因素，同时也显示出与DIT病变程度的相关性，需要进一步研究IEL在粥样硬化发生、发展中的作用。

SMCs是DIT病变的主要参与细胞，既往对其特性和作用分析较少。Caldesmon等可作为SMCs标志物，而Smoothelin只在分化完全的收缩型SMCs中表达[15]，可用于表型鉴定。研究结果显示，IEL完整组内膜细胞主要为分泌型SMCs，而IEL碎片化组内膜细胞明显增多，包含了收缩型与分泌型SMCs。同时，IEL碎片化组出现较多TEM1阳性细胞结果，这提示IEL碎片化组可能发生内膜SMCs表型转化。从染色结果看，IEL碎片化组内膜与中膜内层的SMCs细胞形态及抗原表达接近，提示可能发生了中膜SMCs向内迁移，这一点需要细胞示踪实验证实。进一步分析，分泌型SMCs富含粗面内质网，细胞代谢活跃，具有更高的能量需求[16-17]，这可能是SMCs来源泡沫细胞形成的一个重要因素。动脉粥样硬化是一种发展非常缓慢的疾病，DIT是这一过程最早的阶段，因此平滑肌细胞增殖率很低，无法检测出Ki-67阳性细胞，这一结果与Nakagawa等[18]一致。抗Bax染色提示，IEL碎片化组内膜Bax阴性细胞较正常组明显增加，提示发生了细胞凋亡减少，这可能是DIT内膜平滑肌细胞数量增加及病变进展的原因。

注：A：IEL完整组抗Caldesmon染色；B：IEL碎片化组抗Caldesmon染色；C：IEL完整组抗Smoothelin染色；D：IEL碎片化组抗Smoothelin染色；E：IEL完整组抗Ki-67染色；F：IEL碎片化组抗Ki-67染色；G：IEL完整组抗Bax染色；H：IEL碎片化组抗Bax染色；I：IEL完整组抗TEM1染色；J：IEL碎片化组抗TEM1染色

图2SMCs的增殖、凋亡与表型转化

综上所述，冠脉粥样硬化在终末期IDCM患者中普遍存在。IEL完整性、SMCs表型转化及凋亡降低可能是引起DIT病变进展的重要因素。作为容易被忽视的合并症，IDCM合并冠脉粥样硬化需更进一步的研究。