银杏总黄酮抑制心肌细胞过度自噬对缺血性心力衰竭大鼠心肌重塑和内质网应激的调节①

刘永强 刘 辉 韩培立 周朝元 崔勤涛

(新乡医学院第一附属医院心外科,新乡 453100)

心力衰竭是指心脏收缩、舒张功能障碍，导致静脉系统血液淤积、动脉系统血液灌注不足，常见于心脏疾病终末段，是导致心血管疾病患者死亡的主要因素之一，严重危害公共健康。心肌重塑是其病理基础之一，研究发现内质网应激与自噬在心肌重塑中起重要作用[1，2]。银杏总黄酮(total flavone of ginkgo biloba，TFG)是银杏叶提取物主要活性成分，可改善脑血管循环、保护脑细胞、扩张冠状动脉、提高免疫力，可通过调节自噬减轻心肌缺血再灌注损伤，但TFG介导内质网应激及自噬对心力衰竭影响的报道较少[3,4]。本研究拟分析TFG对IHF大鼠心肌重塑和内质网应激的影响，为心力衰竭临床药物开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 Wistar大鼠60只，雌雄不限，体质量(220±20)g，由武汉华联科生物技术有限公司提供，动物许可证号：SXCN(鄂)2018-0137，按组别分笼饲养，适应性喂养7 d后用于后续实验，自由摄食饮水。

1.1.2试剂与仪器 TGF、美托洛尔片购自阿斯利康制药有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；蛋白抗体购自美国Abcam公司；光学显微镜购自德国Eppendorf公司；qRT-PCR仪购自美国BioRad公司；小动物心电图机购自美国ECGenie公司。

1.2方法

1.2.1模型构建 吸入乙醚法麻醉大鼠，取仰卧位固定，剃去胸前部毛备皮，自左侧3～4肋间作切口开胸，小心暴露心脏，于冠状动脉左前降支起始部位结扎左冠状动脉，排出心包腔内血液和气体，关闭胸腔缝合。缺血性心力衰竭(ischemic heart failure，IHF)建模成功标志：肢体导联Ⅱ导联 ST 段出现上抬[5]。空白对照组大鼠行假手术，仅穿线不结扎，其他操作一致。术后行常规抗感染处理，并保温。

1.2.2分组与给药 60只Wistar大鼠分为空白对照组(Control)、模型组(IHF model)、给药组(25 mg/kg，100 mg/kg TFG)和美托洛尔组[Metoprolol 12 mg/(kg·d)]，每组12只。TFG组和Metoprolol组于建模前灌胃处理，连续7 d，1次/d，Control组和IHF model组给予等体积生理盐水，手术结束后正常饲养4周，进行后续检测。

1.2.3HE染色观察心肌组织损伤 术后4周处死大鼠，取左心室组织，固定于多聚甲醛，脱水、透明，常规石蜡包埋切片(3 μm/片)，HE染色，光学显微镜下随机挑选5个视野，观察病理组织改变情况。

1.2.4qRT-PCR检测心肌组织Caspase-3 mRNA表达 术后4周处死大鼠，取左心室组织，液氮研磨法磨成粉末，冰上加入Trizol裂解液提取总RNA，并检测其纯度、浓度和完整性；取2 μg提取RNA液逆转录合成cDNA，加入荧光染料进行qRT-PCR检测，95℃ 5 s，95℃ 10 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，循环38次。Caspase-3引物序列参考文献[6]：F-5′-ATGGAGAACAATAA-AACCT-3′，R-5′-CTAGTGATAAAA-GTAGAGTTC-3′；GAD PH引物序列：F-5′-ACTCACTCTTCTACCTTTG-ATGCT-3′，R-5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3′。2-ΔΔCT法计算Caspase-3 mRNA相对表达量。

1.2.5免疫组化检测心肌组织Caspase-3 蛋白表达 左心室组织切片脱蜡、水化，滴加封闭通透液浸润，避光处理30 min，内源性过氧化物酶封闭；置于柠檬酸钠缓冲液中煮沸30 min，进行抗原修复；5%羊血清封闭非特异性蛋白，室温孵育30 min；加入一抗(1∶100)4℃孵育过夜；加入二抗37℃孵育30 min；加入SP 37℃孵育；DAB显色，苏木素复染，脱水透明后封片；Caspase-3染色定位于胞浆，呈黄色或棕色。染色结果评分：染色呈黄色或棕色为阳性细胞，阳性细胞占比<10%为阴性，阳性细胞占比≥10%为阳性[7]。2名病理医师独立判定，并共同给出最终结果。

1.2.6心脏超声心动图检查大鼠心肌功能 术后4周采用小动物心电图机检测各组大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)、左室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)、左心室收缩期末容积(left ventricular end systolic volume，LVESV)、左心室舒张末容积(left ventricular end dia-stolic volume，LVEDV)，IHF model组大鼠LVEF≤45%表示造模成功[8]。

1.2.7Western blot检测ERS和自噬相关蛋白表达 术后4周处死大鼠，取左心室组织研磨成粉末，冰上加入RIPA裂解液提取总蛋白，并检测其浓度：取30～50 μg提取蛋白液进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白条带转移至PVDF膜后浸于5%脱脂奶粉中封闭，室温孵育2 h，洗膜后置于相应一抗4℃反应过夜，洗膜后室温孵育二抗40 min，ECL发光液显影。

2 结果

2.1TFG对IHF大鼠心肌损伤的影响 HE染色显示，Control组大鼠心肌细胞结构完整，排列规律整齐，细胞间隙正常；IHF model组大鼠部分心肌细胞结构不完整，排列明显紊乱，细胞间隙增大；TFG给药组心肌细胞排列趋于整齐，细胞间隙明显减少，高剂量组改善效果与Metoprolol组差异无统计学意义，且明显优于低剂量组，见图1。

2.2TFG对IHF大鼠心肌组织Caspase-3表达的影响 免疫组化染色显示，Caspase-3阳性表达定位于胞浆；与Control组相比，IHF model组大鼠心肌组织Caspase-3表达显著上升(P<0.05)；与IHF model组相比，TGF组Caspase-3表达显著下降(P<0.05)，且高剂量组改善效果与Metoprolol组相近，明显优于低剂量组(P<0.05)，见图2。

图1 TFG对IHF大鼠心肌损伤的影响(HE，×200)Fig.1 Effects of TFG on myocardial injury in IHF rats(HE，×200)

图2 TFG对IHF大鼠心肌组织Caspase-3表达的影响Fig.2 Effects of TFG on Caspase-3 expression in myocardial tissues of IHF rats

图3 TFG对IHF大鼠心功能指标的影响Fig.3 Effects of TFG on cardiac function indexes in IHF rats

2.3TFG对IHF大鼠心功能指标的影响 与Control组相比，IHF model组大鼠LVWT、LVWF、FS明显降低，LVESV、LVEDV显著升高(P<0.05)；与HIF model组相比，TGF组LVWT、LVWF、FS明显升高，LVESV、LVEDV显著降低(P<0.05)，且高剂量组改善效果与Metoprolol组差异无统计学意义，明显优于低剂量组(P<0.05)，见图3。

2.4TFG对IHF大鼠心肌组织中内质网应激相关蛋白的影响 与Control组相比，IHF model组大鼠心肌组织CHOP、cleaved Caspase-12表达显著升高，GADD34、Bip表达显著下降(P<0.05)；与IHF model组相比，TFG组CHOP、cleaved caspase-12表达显著下降，GADD34、Bip表达显著上升(P<0.05)，且高剂量组改善效果与Metoprolol组差异无统计学意义，明显优于低剂量组(P<0.05)，见图4。

图4 TFG对IHF大鼠心肌组织内质网应激相关蛋白的影响Fig.4 Effects of TFG on endoplasmic reticulum stress-related proteins in myocardial tissues of IHF rats

图5 TFG对IHF大鼠心肌组织自噬相关蛋白的影响Fig.5 Effects of TFG on autophagy-related proteins in myocardial tissues of IHF rats

2.5TFG对IHF大鼠心肌组织中自噬相关蛋白的影响 与Control组相比，IHF model组大鼠心肌组织Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平显著上升，p62表达显著下降(P<0.05)；与IHF model组相比，TGF组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平显著下降，p62表达显著上升(P<0.05)，且高剂量组改善效果与Metoprolol组差异无统计学意义，明显优于低剂量组(P<0.05)，见图5。

3 讨论

银杏叶作为传统中药，具有活血化瘀、通络、敛肺平喘、化瘀降脂等功效[9]。TFG是银杏叶提取物重要有效成分，具有扩血管、抗氧化作用，对心肌缺血大鼠心肌损伤有保护作用[10,11]。本研究发现TFG预处理IHF大鼠可明显改善其心肌组织损伤，与高子任[12]研究结果相似。

心脏重塑对IHF具有重要作用。本研究发现IHF组大鼠术后4周心脏功能指标(LVEF、FS、LVWT、LVESV和LVEDV)出现明显恶化，提示IHF模型大鼠复制成功。而TFG预处理的IHF大鼠心功能明显改善，提示TFG对IHF左心重塑具有保护作用。心肌细胞凋亡对心脏重塑的进展至关重要，Caspase-3是细胞凋亡通路的主要执行者，本研究发现TFG预处理可减少IHF大鼠心肌组织Caspase-3表达，提示TFG可减少IHF大鼠心肌细胞凋亡，与文献[13]结论相符。

ERS参与多种疾病发生发展，研究发现，ERS诱导的过度自噬和凋亡对心脏重塑起重要作用[14]。ERS涉及多种蛋白，ERS相关蛋白包括：CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhace-binding protein homologous protein，CHOP)、切割后半胱天冬酶12(cleaved Caspase-12)、生长停滞与DNA损害可诱导蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34，GADD34)、免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein，Bip)；自噬相关蛋白：Beclin1、p62、微管相关蛋白1轻链3蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。未折叠蛋白积累时会导致Bip从内质网上脱离，从而调控下游ERS蛋白转录，导致蛋白合成终止，而GADD34可恢复蛋白质翻译功能。同时，ERS发生后细胞会表达凋亡相关蛋白，抵御ERS造成的不利影响，如核转录因子CHOP其表达可激活Caspase-12，引起细胞凋亡[15]。本研究发现，TFG预处理可下调IHF大鼠心肌组织CHOP、cleaved Caspase-12表达，并上调GADD34、Bip表达，提示TFG可减少ERS对IHF大鼠心肌细胞损伤，可能与调节CHOP、cleaved Caspase-12、GADD34及Bip水平有关。自噬是细胞降解多余细胞器、蛋白及老化细胞的过程，罗丹等[16]报道心肌细胞的过度自噬参与心脏重塑。LC3是自噬中的关节蛋白，其亚型LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ是自噬激活的重要标志；Beclin1是一种抑癌基因，其编码的蛋白可与PI3K形成复合物调节自噬活性，p62是一种泛素结合蛋白，可与自噬小体上的LC3Ⅱ形成复合物，其水平可间接反映自噬小体清除水平[17，18]。本研究发现，TFG可下调IHF大鼠心肌组织中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，上调p62表达，提示TFG可减少自噬对IHF大鼠心肌细胞损伤，可能与调节Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62水平有关。

本研究证实TFG可抑制心肌细胞过度自噬对IHF大鼠心肌重塑和ERS进行调节，且高剂量TFG的作用效果与常规心力衰竭药物美托洛尔片相近，可为心力衰竭的临床用药提供参考。