对在注射剂研发过程中无菌检查的思考

徐兴鲁 邢立超 王少鹏 王 丹

山东新创生物科技有限公司 山东 济南250000

注射剂系指药物制成的供注入体内的无菌溶液以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，作为药品的一种重要剂型被广泛地应用于临床，由于其直接注入人体体内，发挥疗效，因此其安全性显得更为重要。无菌检查是体现灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的一个重要指标。

无菌检查法一般分为两种方法：直接接种法和薄膜过滤法。直接接种法即每支(或瓶)供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径为0.45μm，直径约为50 mm。根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面；冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100 ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。

方法验证：1.薄膜过滤法是将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。取一支装有同体积培养基的容器，加入等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温度培养3～5天。各试验菌同法操作。2.直接接种法是指取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1 ml(含菌小于100 cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等，更换滤膜品种等方法消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。

下面谈一下在药物研发过程中遇到问题的思考：

1.样品取样量方面：检验数量是指一次检验所用供试品最小包装容器的数量；检验量是指一次试验所用的供试品总量。检验量的表格不包括阳性对照用的用量，虽然有专门说明，但仍容易忽略。无菌检查应保证检验数量以使试验结果具有代表性；而阳性对照和验证试验满足检验量总量要求即可以检验样品对试验结果的影响，即保证实验结果的可靠性。

2.样品处理方面：注射剂有不同剂型，对于注射液还比较好过滤，但对于其他剂型要注意处理方式。如粉针剂，要关注固体样品的溶解、转移、均匀分配问题，通常将规定取样量全部转移到500 ml稀释剂或适宜溶液中，再进行分配。在对可溶于十四烷酸异丙酯的油类供试品进行处理时，无菌的十四烷酸异丙酯用量需经方法学验证。3.培养基与菌种方面：做无菌实验前进行培养基的适用性检查是很有必要的，培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，以确保初步环节可靠。验证用菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，中检所老师要求应加上大肠埃希菌，一共七株菌，对每一试验菌应逐一进行验证；由于使用频繁，对菌种的要求为不得超过5代，采用适宜的方法保存；加菌量应小于100cfu，一般100cf u比较合适，过多过少均影响判断结果。有的申报资料中未提供试验菌的浓度，这一点往往被忽视。4.操作方法方面：直接接种法取样量少，方法繁琐，且易受外源性细菌污染，对操作者和操作环境要求高，对实验结果的影响较大。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单。该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对实验结果的可信性影响较小。取样量大于5 ml/支直接接种法不再适用，发展趋势采用全封闭的薄膜过滤法。

5.快速无菌检查法：开展快速无菌检测技术研究的意义在于，传统无菌试验至少耗时14天，对有效期短的产品，如体细胞治疗产品、基因治疗产品等，以及生产过程中间产品、原液及半成品快速的使用，缩短生产周期，在较短的时间之内放行和使用。