过表达ADAM10通过Notch/Akt信号通路抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡

张 浩，左和平，刘泽岩，丁旵东

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是临床上较为常见的、致死率较高的心血管疾病，冠状动脉急性或持续性缺血缺氧造成的心肌细胞死亡是AMI早期的重要事件，也是引起心肌重构及心力衰竭的重要因素之一[1]。因而通过寻找有效分子靶点来阻断心肌细胞凋亡，已逐渐成为研究AMI损伤修复的热点领域。解整合素金属蛋白酶10(a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)是一种锚定于细胞膜表面的I型跨膜蛋白，参与细胞黏附、融合以及膜蛋白脱落和蛋白水解等多种生物学过程[2]。有研究[3]显示，ADAM10能够水解Notch蛋白膜外段受体，该过程是Notch通路活化的最关键步骤。而Notch信号通路不仅在哺乳动物胚胎期心脏发育中发挥重要作用，还参与哺乳动物成年后各类心脏疾病的调控[4]，包括AMI。尤其在心肌缺血时，激活Notch信号通路可通过诱导血管生成、抑制心肌细胞凋亡，发挥改善心肌缺血再灌注损伤的作用[5]。因而据此推测ADAM10有可能通过Notch途径参与AMI所致心肌细胞凋亡的调控，但目前鲜有报道。现通过心肌原位注射ADAM10腺病毒，观察ADAM10过表达对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制是否是经激活Notch/Akt信号通路实现，以期为AMI的治疗提供新的潜在分子靶点。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂6～7周龄健康清洁级雄性SD大鼠40只，体质量250～300 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0010。所有大鼠均在(23±2)℃，相对湿度40%～70%，12/12 h光照周期条件下饲养，并自由饮食和摄水。ADAM10过表达质粒(GV345)构建及其腺病毒(2×1010PFU/ml)包装、浓缩和纯化均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成；TRIzol试剂购自美国ThermoFisher Scientific公司；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3, 5-triphenyl tetrazolium chloride，TCC)染色试剂购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗ADAM10多克隆抗体购自美国Novus Biologicals公司；兔抗Akt多克隆抗体、兔抗磷酸化Akt(Ser473)单克隆抗体、兔抗Cleaved-caspase-3多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、兔抗Hes家族bHLH转录因子1(Hes1)均购自美国CST公司；兔抗Notch受体1(Notch1)单克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1AMI模型建立及分组处理 40只大鼠被随机均分为假手术(sham)组、AMI组、空载腺病毒(Ad-NC)组和ADAM10腺病毒(Ad-ADAM10)组。除sham组外，其余各组大鼠均采用冠状动脉左前降支结扎术[6]建立AMI模型，而sham组大鼠仅采取冠状动脉左前降支穿线而不结扎。若观察到结扎局部下方或左心室变白，心率较为缓慢，并且Ⅱ导联心电图ST段抬高呈弓背向上型，表明AMI模型制备成功[7]。随后，AMI组、Ad-NC组和Ad-ADAM10组于心肌梗死区域选择3个位点分别注射10 μl生理盐水、空载腺病毒(2×1010PFU/ml)和ADAM10腺病毒(2×1010PFU/ml)，sham组于相同区域注射等量生理盐水。术后72 h大鼠全部存活并处死大鼠，取心脏于-80℃保存备用。

1.2.2超声心动图评估心脏功能 术后72 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，对大鼠进行心脏超声检测，记录左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室缩短分数(left ventricular shortening score，LVFS)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)和左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)。

1.2.3RT-PCR检测心肌组织中ADAM10mRNA表达水平 取各组大鼠心脏梗死边缘区域心肌组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，分光光度计测量RNA纯度。取2 μg RNA逆转录成cDNA，随后以cDNA为模板，按照SYBR Green qPCR Mix说明书操作进行PCR扩增。引物序列：ADAM10上游引物为5’-AAGAAGCTT CCCACAAGGCA-3’，下游引物为5’-TGTGTACGCAGAGTATCTAACTGG-3’； GAPDH上游引物为5’-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3’，下游引物为5’-ATCC GTTGACTCCGACCTTC-3’。PCR条件：95 ℃预变性15 min；95℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算ADAM10 mRNA相对表达量。

1.2.4TCC染色评估心肌梗死面积 取冻存心脏组织，在心尖到结扎点间进行冰冻切片，厚度4 μm，将切片置于1%的TCC染液中，于水浴箱中37 ℃避光孵育15 min，正常心肌区域被染成红色，梗死区域被染成白色，染色后即可拍照观察。采用Image-Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积所占百分比，梗死面积百分比=白色区域面积/切面总面积×100%。

1.2.5TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 取冻存的结扎线以下部分左心室心肌，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋后切片，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，光镜下拍照观察。凋亡细胞的细胞核被染成棕褐色，每张切片随机选取5个视野，统计阳性细胞和总细胞数目，凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6Western blot检测相关蛋白表达水平 取冻存的结扎线以下部分左心室心肌组织，加入适量RIPA裂解液后冰上研磨20 min，4 ℃下12 000 r/min 离心25 min，收集上清液，采用BCA法进行蛋白定量。取20 μg蛋白进行10% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，再将蛋白转移PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭30 min，分别加入ADAM10(1 ∶1 000)、Cleaced-caspase-3(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Notch1(1 ∶500)、Hes1(1 ∶500)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(ser473)(1 ∶1 500)和GAPDH(1 ∶2 000)等一抗，4 ℃孵育过夜。次日，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗(1 ∶10 000)，室温孵育1 h，洗涤后加入ECL超敏发光液，显影。以目的条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 过表达ADAM10对大鼠心肌组织中ADAM10表达的影响如图1所示，与sham组比较，AMI组大鼠心肌组织中ADAM10 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；与AMI组比较，Ad-ADAM10组大鼠心肌组织中ADAM10 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)，而Ad-NC组与AMI比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 过表达ADAM10对大鼠心脏功能及心肌梗死的影响如表1所示，与sham组比较，AMI组大鼠心脏功能参数值LVEF和LVFS降低(P<0.05)，LVDd和LVDs升高(P<0.05)；与AMI组比较，Ad-ADAM10组大鼠心脏功能参数值LVEF和LVFS升高(P<0.05)，LVDd和LVDs降低(P<0.05)，而Ad-NC组与AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外，sham组大鼠未见心肌梗死，与AMI组比较，Ad-ADAM10组大鼠心肌梗死面积减小(P<0.05)，而Ad-NC组与AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组大鼠心肌组织中ADAM10蛋白及mRNA的表达

A：ADAM10 mRNA；B：ADAM10 蛋白；1：sham组；2：AMI组；3：Ad-NC组；4：Ad-ADAM10组；与sham组比较：*P<0.05；与AMI组比较：###P<0.001

2.3 过表达ADAM10对大鼠心肌组织细胞凋亡的影响如图2所示，sham组心肌TUNEL染色切片呈现的棕褐色阳性染色细胞少，凋亡率低；与sham组比较，AMI组切片呈现的阳性染色细胞增多，细胞凋亡率升高(P<0.05)；与AMI组比较，Ad-ADAM10组切片呈现的阳性染色细胞又减少，细胞凋亡率降低(P<0.05)，而Ad-NC组与AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时，与sham组比较，AMI组心肌组织凋亡蛋白Cleaved-caspase-3和Bax表达水平增加(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低(P<0.05)；而与AMI组比较，Ad-ADAM10组Cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达水平又降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平又升高(P<0.05)，且Ad-NC组与AMI组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图2 TUNEL染色 ×100

1：sham组；2：AMI组； 3：Ad-NC组；4：Ad-ADAM10组；与sham组比较：**P<0.01; 与AMI组比较：#P<0.05

表1 各组大鼠心脏功能及心肌梗死面积比较

与sham组比较：*P<0.05，**P<0.01；与AMI组比较：#P<0.05，##P<0.01

图3 各组大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达水平

1：sham组；2：AMI组；3：Ad-NC组；4：Ad-ADAM10组；与sham组比较：**P<0.01,***P<0.001；与AMI组比较：##P<0.01,###P<0.001

2.4 过表达ADAM10对大鼠心肌组织Notch/Akt信号通路的影响如图4所示，与sham组比较，AMI组大鼠心肌组织中Notch1、Hes1蛋白表达水平以及Akt磷酸化水平降低(P<0.05)；与AMI组比较，Ad-ADAM10组Notch1、Hes1蛋白表达水平以及Akt磷酸化水平升高(P<0.05)，而Ad-NC组与AMI组比较差异无统计学意义。

3 讨论

ADAM10是一种具有多个功能结构域的跨膜蛋白，其不仅参与其他膜蛋白的水解过程，而且还参与细胞黏附及各种细胞信号的转导过程，在正常生理以及病理状态下均发挥重要作用。ADAM10在脊髓动物心脏发育及血管形成过程中也起到关键作用。例如，Farber et al[8]研究显示，ADAM10通过Notch通路调控小鼠冠状动脉的分化，其缺失将导致冠状动脉分化的缺陷。Li et al[9]报道称，通过阻断ADAM10水解N-cadherin蛋白可有效改善扩张型心肌病大鼠的心室重构。王博石 等[10]研究证实，ADAM10基因突变可导致人类先天性心脏缺陷。此外，ADAM10是Notch活化的关键调控因子[3]，而Notch信号元件的突变或缺失也会导致心脏瓣膜畸形、心脏心室发育不全、心室分隔障碍等众多心脏疾病[11]。因此，ADAM10与多种心脏疾病的发生发展密切相关，然而ADAM10是否经Notch信号通路参与AMI调控，目前还未曾报道。本研究显示，心肌原位注射ADAM10过表达腺病毒能够抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡，改善心功能，并激活Notch/Akt信号通路，提示ADAM10可能成为治疗AMI的一个潜在靶点。

1：sham组；2：AMI组；3：Ad-NC组；4：Ad-ADAM10组；与sham组比较：*P<0.05；与AMI组比较：###P<0.001

AMI是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起心肌坏死的过程。本研究采用冠状动脉左前降支结扎术构建AMI模型，能够较好的再现AMI的发病过程，使研究更贴近实际病理条件，也使研究结果更加可信。此外，AMI常伴有进行性心电图变化及心功能改变，因此心脏超声检查是评价AMI时心功能的重要辅助手段。本研究结果显示，与sham组比较，AMI组大鼠LVEF和LVFS值降低，LVDd和LVDs值升高，并且AMI组大鼠出现较大面积的心肌梗死和较高心肌细胞凋亡率，表现出明显的心功能下降及严重的心肌梗死和心肌细胞凋亡的现象。为了进一步探讨ADAM10在心肌梗死过程中的作用，本研究通过心肌组织原位注射ADAM10过表达腺病毒以提高心肌组织中ADAM10表达水平，结果表明ADAM10过表达能提高AMI大鼠心功能LVEF和LVFS值、降低LVDd和LVDs值，并降低心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率，提示ADAM10过表达能改善AMI大鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡。然而，李小鸥 等[12]研究发现敲低ADAM10表达能改善阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠心功能，这可能是由于扩张型心肌病与AMI病理机制不一致以及ADAM10行使功能不同所导致。

心肌细胞凋亡是AMI心肌梗死区最重要的病理特征，而细胞凋亡是一种受多种基因调控的程序性死亡过程。在细胞凋亡早期，Bax可介导线粒体内外膜间隙中凋亡启动因子Cyt C释放至胞质，激活Caspase-9启动Caspase级联反应，最终由Caspase-3执行凋亡作用，而抗凋亡蛋白Bcl-2可与Bax结合成二聚体抑制Bax行使功能[13]。本研究结果显示，与sham组比较，AMI组大鼠心肌组织中Cleaved-caspase-3水平及Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白水平降低，说明AMI大鼠心肌细胞凋亡水平较高。然而，ADAM10过表达可降低Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平，提高Bcl-2蛋白表达水平，说明ADAM10过表达可抑制AMI大鼠心肌细胞凋亡。

有研究[14]显示，在胚胎期未成熟的心肌细胞中Notch1被激活以促进其发育和增殖，然而在出生后成熟的心肌细胞中Notch1被下调。同时，Zhou et al[15]研究显示，过表达Notch1能够促进缺氧复氧条件下心肌细胞的存活。此外，Notch1还可以通过激活下游Akt途径抑制心肌细胞凋亡[16]。鉴于是Notch活化的关键调控因子，据此推测ADAM10过表达有可能通过激活Notch/Akt信号通路抑制AMI心肌细胞凋亡。结果显示，与AMI组比较，ADAM10过表达也可提高Notch1、Hes1蛋白表达水平以及Akt磷酸化水平，说明ADAM10过表达是通过激活心肌组织中Notch/Akt信号通路来抑制心肌细胞凋亡，从而改善AMI大鼠心功能。

综上所述，本研究结果证实过表达ADAM10能够通过激活Notch/Akt信号通路抑制心肌细胞凋亡，改善AMI大鼠心功能。因而，ADAM10有可能为AMI的靶向治疗提供新的线索和论据。