大黄素激活Nrf2/ARE/HO-1信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能保护作用

崔勤涛，王俊华，刘晓晨，王学惠，马海英，苏国宝

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)是心肌在缺血性损伤之后，恢复血液流通进一步造成更为严重的二次损伤的过程。常常导致心肌代谢紊乱和结构损伤，具有较高的死亡率和致残率。MIRI有着复杂的病理生理学机制，涉及诸如活性氧多度产生、炎症反应、钙超载、线粒体紊乱等一系列病理变化，氧化应激在其中扮演着最为重要的角色[1]。大黄素是传统中药大黄的提取物，是一种蒽醌类衍生物，具有抗感染、免疫调节以及抗氧化等药理作用[2]。研究[3]表明，大黄素在大鼠MIRI中具有保护作用，然而对其保护作用机制的研究报道还有很多空缺。现通过建立心肌缺血再灌注大鼠模型，探讨在MIRI大鼠心肌中大黄素对Nrf2/ARE/HO-1信号通路的激活作用及其对MIRI的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂大黄素、辛伐他汀购自北京索莱宝科技有限公司；ML385购自美国Selleck有限公司；NBT染色液、HE染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、DAB显色液、ECL显色液购自上海碧云天生物技术研究所；髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒购自南京建成生物研究所；裂解型半胱天冬酶3(cleaved Caspase-3)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)、血红素氧化酶1(heme oxygenase 1, HO-1)一抗购及对应的二抗购自美国Santa Cruz公司；动物人工呼吸机ALC-V108购自上海奥尔科特生物科技有限公司；实验动物心电图及购自上海精密仪器科学有限公司；全自动生化分析仪购自日本日立公司；HT7700透射电镜购自日本hitachi公司；超波切片机购自德国徕卡公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验动物及分组处理80只(体质量200～250 g)健康雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，恒温恒湿，明暗12 h交替的环境下在本院实验动物中心喂养1周。48只大鼠随机均分为假手术组、MIRI模型组、辛伐他汀40 mg/kg组、大黄素20、40、60 mg/kg组；假手术组和MIRI模型组大鼠每日采用等量生理盐水灌胃，辛伐他汀40 mg/kg组采用40 mg/kg辛伐他汀灌胃作为阳性对照，大黄素20、40、60 mg/kg组每日采用对应剂量的大黄素进行灌胃，灌胃每天给药1次，连续10 d，建模前大鼠禁食禁水12 h，在最后1次灌胃45 min后建立大鼠MIRI模型。此外，另设32只大鼠随机均分为假手术组、MIRI模型组、大黄素处理组、大黄素+ML385处理组；假手术组、MIRI模型组按照前述对应组别处理方法进行处理，大黄素处理组按照前述大黄素60 mg/kg组的处理方法进行处理，大黄素+ML385处理组在大黄素60 mg/kg组处理方法的基础上，在建模前的1 h腹腔注射30 mg/kg的Nrf2抑制剂ML385进行处理。

1.3 MIRI模型建立采用结扎冠状动脉前降支法建立MIRI模型，大鼠通过4%水合氯醛腹腔注射麻醉后打开胸腔，剪开心包，暴露心脏，其中假手术组不进行结扎处理，其余各组于大鼠左冠状动脉前降支起始段2 mm处穿线进行结扎，以心肌颜色从红色变成灰白色，并且心电图ST段明显抬高作为结扎成功的标志，结扎30 min后，松开结扎线恢复血流，造成缺血再灌注，再灌注持续2 h后，处死大鼠用于后续实验。

1.4 心功能检测麻醉的大鼠固定后，经右侧颈动脉插管至左心室，连接心电图，检测大鼠左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、左室内压力变化最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.5 心肌梗死面积检测取大鼠心脏，4 ℃生理盐水清洗3次后称重，将心室肌切片，0.125% NBT染色液染色15 min，梗死区域为灰白色，非梗死区域为暗紫色，将梗死区心肌剪下称重，心肌梗死面积通过梗死区心肌重要占全心肌重量的百分比来表示。

1.6 心肌损伤标志物检测再灌注2 h后，抽取颈动脉血6 ml，静置30 min，离心分离血清，-80 ℃冰箱中保存血清，采用全自动生化分析仪检测肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogegnase, LDH)和肌钙蛋白(troponin, cTnI)浓度。

1.7 HE染色检测心肌组织病理性改变4%多聚甲醛固定心肌组织24 h，通过乙醇梯度脱水30 min后，二甲苯透明处理，石蜡包埋切至2 μm薄片， HE染色液进行染色，显微镜下观察结果并拍照。

1.8 免疫组化检测cleaved Caspase-3阳性细胞率心肌组织石蜡包埋切片后，60 ℃恒温箱烘烤2 h，通过二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化切片，3%过氧化氢消除内源过氧化物酶活性，清洗后PBS缓冲液中进行抗原修复，山羊血清封闭15 min，滴加cleaved Caspase-3一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗后加入二抗室温孵育2 h，PBS清洗后通过DAB显色液进行显色，苏木精复染，清洗之后进行脱水、透明、封片，显微镜下观察结果并拍照，Image Plus图像分析软件分析阳性细胞数和总细胞数，阳性细胞率 = 阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.9 氧化应激标志物检测取心肌组织，洗涤后在冰冷的磷酸钾缓冲液中匀浆处理，离心取上清液，采用对应的试剂盒进行检测MPO、MDA和SOD在组织中含量。

1.10 Western blot检测蛋白表达取心肌组织，通过RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒对各组总蛋白进行定量，通过上样缓冲液沸水浴10 min，每组各取20 μg总蛋白进行上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，半干转膜法转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，弃残液，1 ∶1 000 cleaved Caspase-3一抗4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗后加入1 ∶200辣根过氧化物酶标记的IgG二抗室温孵育2 h，通过ECL显色液进行显影，凝胶成像仪扫描灰度值进行相对定量。

2 结果

2.1 大黄素对大鼠心脏功能的保护作用如表1所示，与假手术组比较，MIRI模型组心功能指标LVEDP升高(P<0.01)，同时LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低(P<0.01)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，辛伐他汀40 mg/kg组LVEDP降低(P<0.01)，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.01)，差异有统计学意义；大黄素40、60 mg/kg组LVEDP降低(P<0.05，P<0.01)，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.05，P<0.01)，差异有统计学意义。

2.2 大黄素减轻MIRI大鼠心肌损伤如表2所示，与假手术组比较，MIRI模型组心肌梗死面积、CK、LDH和cTnI浓度均升高(P<0.001)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，辛伐他汀40 mg/kg组心肌梗死面积、CK、LDH和cTnI浓度降低(P<0.01)，差异有统计学意义；大黄素40 、60 mg/kg组心肌梗死面积、CK、LDH和cTnI浓度降低(P<0.01)，差异有统计学意义。

表1 大鼠心脏功能指标检测

与假手术组比较:**P<0.01；与MIRI模型组比较:#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠心肌损伤指标检测

与假手术组比较：***P<0.001；与MIRI模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.3 大黄素减轻MIRI大鼠心肌组织病理变化如图1所示，假手术组心肌纤维排列整齐，无纤维结构改变；MIRI模型组心肌纤维紊乱，出现肌丝溶解，空泡变性等病理变化；辛伐他汀40 mg/kg组和大黄素40、60 mg/kg组病理变化较MIRI模型组得到明显改善。

图1 HE染色检测大鼠心肌组织病理变化 ×400

A：假手术组；B：MIRI模型组；C：辛伐他汀40 mg/kg组；D：大黄素20 mg/kg；E：大黄素40 mg/kg；F：大黄素60 mg/kg

2.4 大黄素减轻MIRI大鼠心肌细胞凋亡如图2所示，与假手术组比较，MIRI模型组心肌cleaved Caspase-3阳性细胞率增加(P<0.001)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，辛伐他汀40 mg/kg组阳性细胞率减少(P<0.01)，差异有统计学意义；大黄素20 、40 、60 mg/kg组阳性细胞率减少(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，差异有统计学意义。

2.5 大黄素减轻MIRI大鼠氧化应激水平如表3所示，与假手术组比较，MIRI模型组大鼠心肌组织中MPO、MDA含量升高(P<0.01)，同时SOD含量降低(P<0.01)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，辛伐他汀40 mg/kg组大鼠心肌组织中MPO、MDA含量降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)，差异有统计学意义；大黄素40 、60 mg/kg组大鼠心肌组织MPO、MDA含量降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)，差异有统计学意义。

表3 大鼠心肌组织氧化应激标志物检测

与假手术组比较：**P<0.01；与MIRI模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

图2 免疫组化检测大鼠心肌组织cleaved Caspase-3阳性细胞率 ×400

a：假手术组；b：MIRI模型组；c：辛伐他汀40 mg/kg组；d：大黄素20 mg/kg组；e：大黄素40 mg/kg组；f：大黄素60 mg/kg组；与假手术组比较：***P<0.001；与MIRI模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.6 大黄素促进Nrf2/ARE/HO-1信号通路激活如图3所示，与假手术组比较，MIRI模型组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，辛伐他汀40 mg/kg组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白水平进一步升高(P<0.01)，差异有统计学意义；大黄素40 、60 mg/kg组Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.05，P<0.01)，差异有统计学意义。

2.7 ML385抑制大黄素对Nrf2/ARE/HO-1信号通路的激活作用如图4所示，与假手术组比较，MIRI模型组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白水平升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，大黄素处理组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白水平进一步升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与大黄素处理组比较，大黄素+ML385处理组心肌组织Nrf2和HO-1蛋白水平降低(P<0.01)，差异有统计学意义。

图3 Western blot检测大鼠心肌组织Nrf2/ARE/HO-1通路蛋白表达

a：假手术组；b：MIRI模型组；c：辛伐他汀40 mg/kg组；d：大黄素20 mg/kg组；e：大黄素40 mg/kg组；f：大黄素60 mg/kg组；与假手术组比较：**P<0.01；与MIRI模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

a：假手术组；b：MIRI模型组；c：大黄素处理组；d：大黄素+ML385处理组； 与假手术组比较：**P<0.01；与MIRI模型组比较：##P<0.01；与大黄素处理组比较：&&P<0.01

表4 ML385处理大鼠心功能及心肌损伤标志物检测

与假手术组比较：**P<0.01，***P<0.001；与MIRI模型组比较：##P<0.01；与大黄素处理组比较：&&P<0.01

2.8 ML385抑制大黄素对心肌的保护作用如表4所示，与假手术组比较，MIRI模型组大鼠心功能指标LVEDP升高(P<0.01)，LVSP降低(P<0.01)，同时血清中CK和LDH浓度升高(P<0.001)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，大黄素处理组大鼠LVEDP降低(P<0.01)，LVSP升高(P<0.01)，并且血清CK和LDH浓度降低(P<0.01)，差异有统计学意义；与大黄素处理组比较，大黄素+ML385处理组大鼠LVEDP升高(P<0.01)，LVSP降低(P<0.01)，而血清CK和LDH浓度升高(P<0.01)，差异有统计学意义。

2.9 ML385抑制大黄素对减轻病理改变的作用如图5所示，假手术组、MIRI模型组以及大黄素处理组的病理变化均与之前的结果一致，相比于大黄素处理组，经过ML385处理的大黄素+ML385组出现明显的心肌纤维紊乱，肌丝溶解，空泡变性等病理变化。

图5 HE染色检测ML385处理大鼠心肌组织病理变化 ×400

a：假手术组；b：MIRI模型组；c：大黄素处理组；d：大黄素+ML385处理组

2.10 ML385抑制大黄素对氧化应激的调控作用如表5所示，与假手术组比较，MIRI模型组大鼠心肌组织MPO升高(P<0.01)，同时氧化应激标志物MDA含量升高(P<0.01)，SOD含量降低(P<0.01)，差异有统计学意义；与MIRI模型组比较，大黄素处理组心肌组织MPO降低(P<0.01)，同时MDA降低(P<0.01)，SOD升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与大黄素处理组比较，大黄素+ML385处理组心肌组织MPO升高(P<0.01)，MDA升高(P<0.01)，SOD降低(P<0.01)，差异有统计学意义。

表5 ML385处理大鼠心肌组织氧化应激标志物检测

与假手术组比较：**P<0.01；与MIRI模型组比较：##P<0.01；与大黄素处理组比较：&&P<0.01

3 讨论

MIRI是常见的临床心脏疾病，常发生于心肌梗死以及心脏搭桥手术、心脏移植手术等手术之后，对治疗的预后产生了严重的影响[4]。传统中药提取成分大黄素被报道在MIRI过程中具有心肌保护作用，Du et al[5]研究表明大黄素以及石竹素预处理可增强线粒体抗氧化成分的产生而减轻MIRI造成的心肌损伤，提示大黄素的保护性作用与增强心肌的抗氧化能力有关[5-6]。本研究检测了大鼠LVEDP、LVSP、±dp/dtmax等心功能指标，显示大黄素的处理减轻了MIRI引起的心功能紊乱。同时本研究检测了大鼠血清中CK、LDH、cTnI等心肌损伤标志物，表明大黄素处理减轻了MIRI造成了心肌损伤。此外通过组织病理染色发现，大黄素处理减轻了MIRI大鼠心肌组织发生的病理性改变，并且cleaved Caspase-3阳性细胞率降低。cleaved Caspase 3是细胞凋亡途径中的执行因子，其水平变化可反映出细胞凋亡发生的情况[7-8]。以上结果表明，大黄素可在MIRI过程中对大鼠心肌发挥保护性作用，与之前的研究结果一致。

氧化应激是一种具有破坏性的生物学反应机制，当诸如活性氧等反应分子过度产生时，动物自身清除过氧化物的能力无法及时清除活性氧，导致体内的氧化和抗氧化平衡被打破，造成组织氧化损伤[9]。当MIRI发生时，过量的活性氧由黄嘌呤氧化酶系统、中性粒细胞异常活化以及线粒体呼吸链功能异常产生，造成了心肌功能损伤以及细胞死亡[10]。在氧化应激发生时，细胞膜脂发生过氧化产生大量MDA，同时伴随着抗氧化酶SOD的消耗，两者常作为衡量氧化应激反应的标志物[11]。MPO是血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要由中性粒细胞、单核细胞分泌，中性粒细胞在MIRI病理过程中扮演着重要角色，MPO可催化产生一系列氧化剂，作用于很多细胞内成分，并最终造成细胞损伤。因此MPO被认为是心血管疾病中连接炎症与氧化应激的枢纽[12]。本研究显示大黄素可提高SOD水平，同时降低MPO和MDA水平，表明大黄素对MIRI大鼠心肌保护作用是通过抑制氧化应激实现的。

Nrf2是诱导细胞产生抗氧化酶以对抗氧化应激的最主要的转录因子，在非胁迫条件下，Nrf2与细胞质中的接头Keap1结合，此时为非活性状态并很快发生泛素化被蛋白酶体降解。当发生氧化应激时，Nrf2与Keap1分离，并进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)相互结合，激活Nrf2下游的基因表达。而HO-1则是Nrf2下游重要的对抗氧化应激的酶类[13]。研究[14]表明Nrf2/ARE/HO-1信号通路在MIRI中对心肌发挥着重要的保护性作用，Nrf2可通过调控心肌细胞凋亡、内质网应激、线粒体功能、抗氧化、抗感染以及自噬等多个方面发挥心肌保护作用。尽管大黄素是否可以通过调控Nrf2/ARE/HO-1信号通路减轻MIRI心肌损伤还未见于报道，而在诸如骨肉瘤等其他疾病中发现的大黄素的调控作用暗示着大黄素减轻MIRI心肌损伤的作用可能与Nrf2/ARE/HO-1信号通路有关[15]。本研究显示大黄素可在氧化应激引起Nrf2/ARE/HO-1信号通路激活的基础上，进一步提高通路的活化水平。通过Nrf2抑制剂对Nrf2/ARE/HO-1信号通路进行抑制后发现，大黄素对心肌功能、心肌损伤、病理改变以及氧化应激各指标的调控作用均受到抑制。结果表明大黄素对MIRI大鼠心肌保护作用与Nrf2/ARE/HO-1信号通路的激活有关。

综上所述，大黄素可通过激活Nrf2/ARE/HO-1信号通路，提高HO-1等抗氧化应激基因的表达，从而抑制氧化应激水平，缓解MIRI大鼠心肌损伤及功能紊乱。本研究初步探究了Nrf2/ARE/HO-1信号通路在大黄素对MIRI心肌保护中所发挥的作用，为大黄素MIRI治疗的临床应用提供了新的实验基础。