维生素D及维生素D受体在慢性乙型肝炎患者体内表达水平及抗病毒相关机制的研究

汪玲妹，管世鹤，张 浩，杨 凯，汪 静，严荣荣，李太平，李 姣

维生素D(vitamin D，Vit D)是一种常见的维生素，既往认为其主要参与机体骨钙磷代谢，最新研究[1]表明Vit D具有调节先天性免疫和适应性免疫的重要作用，且Vit D缺乏与各种自身免疫性疾病、病原体感染等风险增加相关。Vit D的基线水平与VDR基因多态性影响病毒性肝炎的自然病程以及聚乙二醇化干扰素(pegylated interferon，Peg-IFN)治疗的反应[2-3]。进一步研究[4]发现，Vit D能够通过增强IFN-α诱导的基因表达，增强IFN-α对丙型肝炎病毒复制的抑制作用，而非活性维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)能够结合STAT1进而抑制JAK-STAT信号转导途径。目前，关于Vit D、VDR在CHB中作用尚未完全清楚, 为此该研究分析了CHB患者Vit D、VDR表达与乙型肝炎相关指标关系，同时通过体外细胞系研究Vit D和IFN-α单独及联合处理对HBV复制水平的影响及其可能存在的机制，从而为临床抗HBV治疗提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂和仪器 MEM培养液购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司；细胞培养双抗购自上海碧云天生物科技有限公司；IFN-α购自合肥安科生物公司；Vit D试剂购自上海阿拉丁公司；抗干扰素调节因子9(IFN regulatory factor-9，IRF-9)抗体、抗粘病毒A蛋白(Mx GTPase A，MxA)抗体、抗-VDR抗体均购自英国 Abcam 公司；抗-β-actin 抗体购自美国Affinity公司；山羊抗兔 IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司； ECL底物发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.1.2病例资料 选取2018年1～12月在安徽医科大学第二附属医院感染科收治的CHB患者共计 81例，男63例，女18例。CHB的诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》。排除标准：① 存在其他肝脏疾病如丙型病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化等；②曾接受干扰素和或核苷(酸)类药物抗病毒治疗；③ 癌症或其他严重的慢性疾病；④ 近3个月服用Vit D制剂。选择同期体检人群健康者40例作为健康对照(health control,HC)组。

1.2 方法

1.2.1肝功能指标、Vit D及HBV相关指标定量检测 肝功能指标如：丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、r-谷氨酰基转移酶(gamma-glutamyl transferase，GGT) 由德国西门子全自动生化分析仪 Dimension EXL TM with LM检测，Vit D及 HBV血清学指标分别由瑞士罗氏全自动电化学发光分析仪 Cobas e602和雅培全自动化学发光分析仪 i4000 SR检测。HBV DNA 定量检测按照检测试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司)说明书步骤操作。

1.2.2免疫组织化学染色检测CHB患者肝组织中VDR表达 肝穿标本经超声引导下穿刺取得，采用Power Vision TM二步法对肝组织标本进行染色，操作严格按照产品说明书进行，染色结果由光学显微镜下观察得到。

1.2.3细胞培养及处理 HepG2.2.15细胞以 MEM 培养液添加10% FBS、105IU/L青霉素、105IU/L链霉素，置于37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞计数后, 按5×105/孔接种于12孔板，待HepG 2.2.15细胞生长到70%～80%融合时进行处理，分为空白组、IFN-α(105IU/L)处理组、Vit D(1 μmol/L)处理组和联合处理组。加药处理后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。

1.2.4Western blot技术分析 细胞PBS冲洗3次，各孔加含PMSF(体积比1 ∶100)的RIPA裂解液100 μl，冰上裂解30 min后刮取细胞至EP管，离心(15 000 r/min、30 min，4 ℃)后收集上清液，BCA法进行蛋白定量，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min，冷却，配胶(10%分离胶+5%浓缩胶)电泳分离，半干转法转移到PVDF膜上，室温下用封闭液(5%的牛奶)封闭1 h，TBST清洗3次，加入一抗(抗-IRF-9抗体：1 ∶2 000；抗-MxA抗体：1 ∶1 000；抗-VDR抗体：1 ∶1 00)中4 ℃震荡过夜，第2天清洗后于室温下二抗(山羊抗兔 IgG抗体：1 ∶5 000)中孵育1 h，清洗待用。吸取等量的ECL 2种试剂，混合均匀后均匀涂抹在PVDF膜表面，在自动显影仪上曝光，β-actin 作为内参。

2 结果

2.1 人口学资料及实验室指标本研究纳入CHB组81例，健康对照组(health control，HC)40例，两组年龄及性别特征无统计学差异。与HC组比较，CHB组患者肝功能指标ALT、AST、ALB、ALP、GGT差异有统计学意义(P≤0.001)(表1)。

表1 研究对象基本资料

2.2 CHB患者血清Vit D含量及分布血清Vit D含量在CHB组和HC组分别为(25.04±7.50) ng/ml和(27.71±5.55)ng/ml，差异有统计学意义(P<0.05)。目前广泛接受的Vit D含量定义为正常(>30 ng/ml)、不足(20 ～30 ng/ml)、缺乏(<20 ng/ml)[5]。CHB组中患者血清Vit D含量正常、不足、缺乏比例分别为24.69%(20/81)，45.68%(37/81)、29.63%(24/81)；HC组中Vit D含量正常、不足、缺乏比例分别为30%(12/40)、65%(26/40)、5%(2/40)，CHB患者不同含量Vit D构成与HC组相比差异有统计学意义(P<0.001)(图1)。

2.3 CHB患者血清Vit D水平与肝功能、HBV血清学指标相关性ALT、AST、ALB和 TBIL 是评估CHB严重程度常用的生化指标，尤其 ALT 和AST在CHB临床分期和治疗中具有重要意义。通过Pearson和Spearman相关分析，CHB组血清Vit D水平与ALB呈正相关性(r=0.339，P=0.002)，而与其它肝功生化指标 ALT、AST、TBIL、ALP、GGT间无相关性；CHB 患者血清Vit D水平与HBV DNA呈负相关性(r=-0.274，P=0.013)，与HBsAg 、HBcAb无相关性。HBeAg阳性患者血清Vit D水平(23.43±7.86)ng/ml与HBeAg阴性患者Vit D水平(26.77±6.78)ng/ml相比差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.4 CHB分期与血清Vit D、肝组织中VDR表达关系据ALT、AST、TBIL、ALB等指标将CHB患者分为轻度(n=19)、中度(n=49)、重度(n=13)。血清Vit D水平与CHB严重程度相关，中度CHB患者血清Vit D水平(25.46±6.53)ng/ml及重度CHB患者血清Vit D水平(17.19±3.04)ng/ml低于轻度CHB患者血清Vit D(29.98±7.77)ng/ml，且重度CHB患者血清Vit D水平低于中度CHB患者血清Vit D(图3A)。免疫组化染色显示，CHB患者肝组织VDR表达较健康人群降低，且随肝炎严重程度加重而表达下降(图3B)。

2.5 Vit D和IFN-α单独及联合处理HepG2.2.15细胞后HBV血清学指标及VDR、MxA、IRF-9蛋白表达水平分析经 Vit D单独及联合IFN-α处理HepG2.2.15细胞后，与空白组相比，IFN-α+Vit D联合处理组对 HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg、HBeAg的抑制作用大于 IFN-α组和Vit D组；与IFN-α 组相比，IFN-α+Vit D联合处理组上清液中HBsAg、HBeAg分泌下降，其中HBsAg差异有统计学意义(P<0.05)。运用实时荧光定量 PCR分析细胞上清液HBV DNA，各处理组未见明显抑制作用(表2)。经Vit D单独及联合IFN-α处理后，HepG2.2.15 内VDR、IRF-9 和MxA 蛋白的表达量增高(图4)。

图1 CHB组和HC组血清Vit D含量及分布

图2 CHB患者血清Vit D水平与ALB、HBV DNA关系

图3 CHB分期与血清Vit D、肝组织中VDR表达水平关系 ×200

A：不同程度CHB患者血清Vit D水平；B：VDR在CHB患者及正常肝组织中的表达；a：正常；b：轻度；c：中度；d：重度；与轻度CHB比较：*P<0.05，***P<0.001； 与中度CHB比较：###P<0.001

表2 Vit D和IFN-α单独及联合处理后细胞培养上清液HBV血清学指标

与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01； 与IFN-α组比较：#P<0.05

图4 Vit D和IFN-α单独及联合处理后细胞VDR、MxA、IRF-9蛋白表达水平

3 讨论

Vit D活性形式为1, 25(OH)2D3，一般认为经食物或光照来源的Vit D前体首先在肝脏中被羟化成25(OH)D3，随后在肾脏中被羟化成1, 25(OH)2D3。近来研究[6]发现，Vit D代谢酶也存在于多种组织中，如胎盘、皮肤和免疫细胞，同时，某些信号如IFN或Toll样受体可刺激相关酶表达，使巨噬细胞产生具有生物活性的代谢物1, 25(OH)2D3。Chen et al[7]长期随访128例初治CHB患者发现，CHB患者基线Vit D水平明显低于健康人群，与血清HBV DNA载量呈负相关，经过核苷(酸)类似物治疗后，整体Vit D水平有所上升，且发生e抗原转换CHB患者血清Vit D水平高于e抗原持续阳性患者，提示CHB患者体内Vit D水平对抗病毒疗效有一定的预测价值。本研究通过分析健康体检者、初治CHB患者血清Vit D水平与实验室参数间关系，表明CHB患者血清Vit D水平低于健康体检者，与HBV DNA载量、e抗原状态相关，这也与Chen et al[7]研究一致。

VDR是一种48 ku大小的可溶性蛋白，属于核受体超家族成员，几乎所有组织中都有表达，与Vit D通过配体-受体模式激活，作用于靶基因上的特定DNA序列，进而调节结构基因的表达[8]。研究[9]表明慢性丙型肝炎患者肝脏VDR表达显著低于健康人群，与肝脏损伤严重程度密切相关，并且在获得完全病毒学应答的患者中肝脏VDR表达高于未获得患者，提示慢性丙型肝炎患者体内可能存在Vit D/VDR信号通路的功能下降，进而影响抗病毒效果乃至疾病进程。同样，有体外实验[10]发现VDR在HBV转染细胞中表达下调，相应减少了CAMP、TNF-α等因子表达，不利于Vit D发挥对HBV转录和翻译的抑制作用。此外，有研究[11]报道Vit D可通过VDR抑制TGF-1/SMAD3信号通路，从而抑制肝星状细胞激活以此减轻肝纤维化，通过长期随访提出Vit D基因多态性与丙型肝炎进展有关。本研究显示CHB患者血清Vit D、肝组织中VDR表达与CHB严重程度负相关，提示CHB患者体内可能也存在Vit D/VDR信号通路的功能下降，这可能不利于药物发挥抗病毒作用，甚至加速CHB转变为肝纤维化乃至肝硬化的进程。

有研究[12]表明，Vit D可诱导IFN介导的信号通路的表达，进而发挥抗丙型肝炎病毒效应。本研究显示Vit D处理后HepG2.2.15细胞内抗病毒蛋白MxA表达升高，同时细胞分泌的HBV相关抗原出现下降趋势，提示Vit D可能通过作用于IFN-α JAK-STAT通路，上调抗病毒蛋白MxA表达，进而影响病毒复制。另有研究[6]发现，Vit D与 IFN-α发挥协同效应，增强IFN-α抗病毒活性。本研究进一步采用 Vit D与IFN-α联合处理HepG2.2.15 细胞，显示IRF-9 和MxA 蛋白的表达及对HBV抗原抑制作用较IFN-α单独处理增强，与其研究一致，表明Vit D可能通过增强HepG2.2.15细胞JAK-STAT途径分子IRF-9及下游抗病毒蛋白MxA的表达，抑制HepG2.2.15细胞HBV抗原分泌，增强IFN-α的药效。同时，Bi et al[13]发现较IFN-α单独处理，Vit D与IFN-α联合处理乙型肝炎模型小鼠病毒复制及抗原分泌显著降低，有较好的预后，这可能是加强了药物疗效带来的良好反应。因此，定期监测及维持CHB患者体内一定的Vit D水平可能有助于CHB患者的病情评估以及疾病控制。